[SUCCESSI] Il paziente tedesco II

[friendless]

Ma veramente vai a Washington la settimana prossima? Da sola? Sei stata invitata?

(io sinceramente non so neppure cosa sia amfar)

[Dora]

Ma veramente vai a Washington la settimana prossima? Da sola? Sei stata invitata?

Ma va là!
Ho però prenotato aereo e albergo per Leon. E gli ho pure organizzato un aperitivo con Timothy, una cena con Bob e un dopocena con Paula (visto che ormai me l'ha rubata, mollandomi in compenso da consolare la povera professoressa Collins, in lacrime, manco fosse uno straccio vecchio ).

[nordsud]

In definitiva l'esame HIV DNA rettale di Brown che risultati ha dato? Hanno o non hanno trovato cellule con hiv integrato? Fin dove si possono spingere le tecniche di "conta" nel 2012 al cui paragone gli esami condotti su Brown nel 2008-2009-2010 ( mica un decennio fa ) sembrano arcaici ?

[Dora]

Sfortunatamente, è fin troppo facile immaginare i media generalisti che raccolgono la notizia di questa presentazione e la interpretano in modo selvaggio (p.es. “L’uomo che si diceva essere guarito è ancora infetto!”).

Proprio come temeva Richard, i pûssòns hanno cominciato subito a darsi da fare nel diffondere le *bizzarre* ipotesi di Lafeuillade, senza neppure l'ombra di un dubbio, di una critica, di un sospetto che si tratti di scempiaggini; anzi, peggiorate da dichiarazioni quali "On ne peut donc pas conclure si c'est le VIH initial qui est toujour resté présent à tres faibles quantités, et qui à évolué, ou si ce sont des nouvelles souches acquises lors de raports non protégés. Ce qui est sûr [sûr ], c'est qui la science a fabriqué une chimère qui est séronégative mais porte toujour le VIH, un cas qui reste unique au mond". Aggiungono perfino che al momento non si sa se il paziente sia in grado di trasmettere il virus.
E per di più da fonti mediche in qualche modo "ufficiali" e non attraverso blog (http://www.santenews.eu/2012/06/11/coup ... de-berlin/).
Credo non ci vorrà molto perché arrivi qualche articolaccio di giornale.

C.V.D. (PRWEB, che guarda caso riprende pari pari le rêveries del post in HIV-reservoir, è la stessa agenzia di stampa di cui si serve normalmente Lafeuillade per i suoi comunicati quasi settimanali e il contatto lasciato è il seguente: Alain Lafeuillade - alain.lafeuillade[AT]ch-toulon.fr - (33) 4 94145084. Si saprà, dunque, chi ringraziare per titoli come “L’uomo che si diceva essere guarito è ancora infetto!” che vedremo prossimamente.)



Da http://www.prweb.com/releases/2012/6/prweb9526008.htm

[Dora]

In definitiva l'esame HIV DNA rettale di Brown che risultati ha dato? Hanno o non hanno trovato cellule con hiv integrato? Fin dove si possono spingere le tecniche di "conta" nel 2012 al cui paragone gli esami condotti su Brown nel 2008-2009-2010 ( mica un decennio fa ) sembrano arcaici ?

Scusa, mi era sfuggito il tuo messaggio.
[quote=""Challenges inherent in detecting HIV persistence during potentially curative interventions""]Results. (...) Digital PCR for HIV DNA was negative for 1 copy per 2 million cells with a 95% confidence limit of less than 1.9 copies per million cells. Collagenase-digested rectal biopsy-derived cells were positive for very low levels of HIV DNA but not RNA; no sequence for confirmatory studies could be obtained.[/quote]
Questo è tutto quel che sappiamo. Insieme alle conclusioni di chi ha firmato l'abstract:
[quote=""Challenges inherent in detecting HIV persistence during potentially curative interventions""]Conclusion. Although the subject has had intermittent evidence for HIV persistence in some assays in some laboratories, the extremely low levels of virus which were detected, while pushing the limits of sensitivity and specificity, and the inability to match sequence with the subject's pre-therapy virus make it impossible to conclude that the subject remains HIV infected.[/quote]
Temo che per avere le idee più chiare dovremo aspettare che esca l'articolo.

Non so dire quanto più precise siano oggi, rispetto anche solo a 2 o 3 anni fa, le metodiche di indagine utilizzate in questo studio.
Quello che so è che negli ultimi tempi, direi un paio d'anni, non si fa altro che discutere sull'affidabilità di questi test e su quanto possano essere resi ancor più precisi e sofisticati (vedi, per esempio, l'articolo di Lewin e Rouzioux su AIDS di aprile 2011 - HIV cure and eradication: how will we get from the laboratory to effective clinical trials - di cui credo abbiamo parlato anche qui, che ne fa una rassegna, e vedi anche una recentissima review di Mellors: New Tools for Quantifying HIV-1 Reservoirs: Plasma RNA Single Copy Assays and Beyond).
Se poi cerchi nel sito del CROI, di lavori appena fatti su queste cose ne trovi tanti.

Pareva che simili discussioni fossero un po' un voler spaccare un capello in 4; invece, nel caso individuale di Timothy, si direbbe che avessero un senso.

[skydrake]

[quote=""Challenges inherent in detecting HIV persistence during potentially curative interventions""]Conclusion. Although the subject has had intermittent evidence for HIV persistence in some assays in some laboratories, the extremely low levels of virus which were detected, while pushing the limits of sensitivity and specificity, and the inability to match sequence with the subject's pre-therapy virus make it impossible to conclude that the subject remains HIV infected.[/quote]

In altre parole hanno fatto casino in laboratorio cercando di spingere troppo oltre la sensibilità dei reagenti. Falso allarme.

Potranno fare tutti i giri di parole possibili per nasconderlo, ma sta di fatto che questi ultimi esami sono stati fatti con una metodologia così inattendibile che non andavano neanche tentati e non hanno fatto che aggiungere confusione.

[Dora]

In altre parole hanno fatto casino in laboratorio cercando di spingere troppo oltre la sensibilità dei reagenti. Falso allarme.

Potranno fare tutti i giri di parole possibili per nasconderlo, ma sta di fatto che questi ultimi esami sono stati fatti con una metodologia così inattendibile che non andavano neanche tentati e non hanno fatto che aggiungere confusione.

Non è che voglia ergermi a difensore di Siliciano & co., ma sto facendo alcune considerazioni:

• - con metodiche meno avanzate, Timothy risulta completamente virus-free => eradicato;
  - con le metodiche più avanzate disponibili (e sperimentabili SOLTANTO su di lui), portate ai loro limiti estremi e testate su miliardi di cellule, qualche sparuto RNA virale INCAPACE DI REPLICARSI in certi laboratori si trova, in altri no;
  - se uno degli scopi della ricerca era capire fin dove si può arrivare con questi test, un limite - ancorché variabile - è stato trovato;
  - comunque la si voglia vedere, la ricerca ha ottenuto quanto si prefiggeva => è un successo.

Il problema, per come la vedo io, è che questi risultati preliminari (non dimentichiamo che mancano i sequenziamenti genetici e chissà che altro) sono stati comunicati durante un seminario del quale conosciamo soltanto l'abstract (e la nota di colore che Deeks, presente alla presentazione di Yukl, non ha fatto una piega) e non si è aspettato di renderli noti attraverso un articolo.
È una prassi consolidata. Però, su una questione così importante, manda in confusione chi - come noi - è ignorante, capisce poco e si basa solo su un abstract.
Aggiungi che Lafeuillade, per ragioni probabilmente non confessabili, ci ha messo del suo per intorbidire le acque. E purtroppo anche lui ha avuto successo.

[Leon]

Pareva che simili discussioni fossero un po' un voler spaccare un capello in 4; invece, nel caso individuale di Timothy, si direbbe che avessero un senso.

Intendiamoci: si può benissimo spaccare il capello in quattro in modo che questa operazione sia qualcosa di più e di diverso da una pura sega mentale. PERO':

1) Bisogna dire QUALE capello stai spaccando e A CHE SCOPO, oltre che, alla fine, tirare delle conclusioni che stiano in piedi e siano degne di questo nome. Nella fattispecie:
- si dà per buono che Brown è guarito e si vogliono validare (o meno) dei test "di frontiera"?
- si dà per buona la validità (e il significato virologico!!!) di questi test e si vuole dimostrare che, anche se forse rimane "qualcosina" del virus, e magari pure che va e viene e/o non si riesce a identificare compiutamente, un paziente, in base alla clinica e a altri elementi, può comunque essere considerato guarito?
- come sopra, tranne la conclusione, che diventa che si mette in dubbio che il paziente sia davvero guarito?
- che altro?

2) Bisogna dire COME, di preciso, spacchi il capello, mentre da quattro righette di abstract (delle quali praticamente ZERO sulle metodiche - o ti sembra che cose tipo "different approaches" o "a variety of assays and approaches", *specie in un contesto come questo*, dicano molto più di niente???) non dico noi, ma nemmeno la professoressa Gismondo piuttosto che Capobianchi, e credo perfino tipi come la Collins, che QUALCOSINA di analisi di laboratorio microbiologiche, colture, ecc. direi che lo sanno, riuscirebbero a capire nulla, e soprattutto a sottoporlo a review critica.

Morale: io ritengo che presentare in questo modo, cioè attraverso un mozziconcino buttato lì tra il lusco e il brusco in un congressino di nicchia, un lavoro di tale delicatezza sia stato un errore clamoroso di per sé; poi, le molte quanto oscure allusioni di Çaçaçaça (tu parli come se almeno quella di Deeks e del giubbotto antiproiettile l'avessi capita perfettamente - ne sei proprio sicura?), che credo non abbia capito un cazzo nemmeno lui ma in compenso è sempre mooolto attivo sul fronte media, hanno fatto il resto.

[Dora]

Pareva che simili discussioni fossero un po' un voler spaccare un capello in 4; invece, nel caso individuale di Timothy, si direbbe che avessero un senso.

Intendiamoci: si può benissimo spaccare il capello in quattro in modo che questa operazione sia qualcosa di più e di diverso da una pura sega mentale. PERO':

1) Bisogna dire QUALE capello stai spaccando e A CHE SCOPO, oltre che, alla fine, tirare delle conclusioni che stiano in piedi e siano degne di questo nome. Nella fattispecie:
- si dà per buono che Brown è guarito e si vogliono validare (o meno) dei test "di frontiera"?
- si dà per buona la validità (e il significato virologico!!!) di questi test e si vuole dimostrare che, anche se forse rimane "qualcosina" del virus, e magari pure che va e viene e/o non si riesce a identificare compiutamente, un paziente, in base alla clinica e a altri elementi, può comunque essere considerato guarito?
- come sopra, tranne la conclusione, che diventa che si mette in dubbio che il paziente sia davvero guarito?
- che altro?

Non è che il problema sia che, in realtà, nessuno ha la minima idea di che cosa significhi "guarire dall'HIV" e che la difficoltà del lavoro di Yukl, Siliciano e colleghi sia anche di tipo concettuale, oltre che tecnico?
Questi non stanno solo sperimentando i limiti dei loro metodi di rilevamento del virus, ma anche la necessità di confrontare con una realtà che non gli è per nulla chiara dei concetti che non sono rigidamente definiti ma, anzi, assai vaghi.

Certo, ci sono delle definizioni di massima: dell'enorme casino che è il concetto di "cura funzionale" abbiamo già detto tante volte, osservando come ciascuno ci metta dentro più o meno quel che gli va; ma anche la "cura sterilizzante/eradicazione" potrebbe avere un senso molto meno rigido di quanto pensiamo, non è detto che per eradicazione si debba/possa intendere che OGNI traccia di materiale genetico dell'HIV sparisce dall'organismo. Allora potrebbe essere - come paiono orientarsi le conclusioni dell'abstract - che per eradicazione si intenda, per esempio, l'assenza di virus capace di replicarsi.
In questo modo, le estensioni dei due concetti di cura "funzionale" e cura "eradicante" tendono ad avvicinarsi; potrebbero anche arrivare in parte a sovrapporsi.
Fra l'altro questo, ben al di là di una presunta modestia, spiegherebbe le cautele e i tentennamenti di Hütter quando deve definire lo stato di Timothy: non sa come definirlo.

Lo sto dicendo male, mi rendo conto di essere un po' confusa, ma è la prima volta che rifletto su questa cosa, che in realtà è molto più un problema filosofico che scientifico. Ci penserò su.

2) Bisogna dire COME, di preciso, spacchi il capello, mentre da quattro righette di abstract (delle quali praticamente ZERO sulle metodiche - o ti sembra che cose tipo "different approaches" o "a variety of assays and approaches", *specie in un contesto come questo*, dicano molto più di niente???) non dico noi, ma nemmeno la professoressa Gismondo piuttosto che Capobianchi, e credo perfino tipi come la Collins, che QUALCOSINA di analisi di laboratorio microbiologiche, colture, ecc. direi che lo sanno, riuscirebbero a capire nulla, e soprattutto a sottoporlo a review critica.

Sì, credo che il problema sia anche qui: come al solito, da un abstract si rischia di fare una gran confusione. Quante volte è già accaduto che venissi da te a frignare, perché non capivo niente di un abstract?

Morale: io ritengo che presentare in questo modo, cioè attraverso un mozziconcino buttato lì tra il lusco e il brusco in un congressino di nicchia, un lavoro di tale delicatezza sia stato un errore clamoroso di per sé

Ti ripeto quello che ho scritto nell'ultimo messaggio, così non faccio fatica:

Il problema, per come la vedo io, è che questi risultati preliminari (non dimentichiamo che mancano i sequenziamenti genetici e chissà che altro) sono stati comunicati durante un seminario del quale conosciamo soltanto l'abstract (e la nota di colore che Deeks, presente alla presentazione di Yukl, non ha fatto una piega) e non si è aspettato di renderli noti attraverso un articolo.
È una prassi consolidata. Però, su una questione così importante, manda in confusione chi - come noi - è ignorante, capisce poco e si basa solo su un abstract.

le molte quanto oscure allusioni di Çaçaçaça (tu parli come se almeno quella di Deeks e del giubbotto antiproiettile l'avessi capita perfettamente - ne sei proprio sicura?), che credo non abbia capito un cazzo nemmeno lui ma in compenso è sempre mooolto attivo sul fronte media, hanno fatto il resto.

No, non ne sono sicura. L'ho interpretata così: Yukl, senza accorgersene (perché altrimenti si sarebbe protetto) lancia quella che Lafeuillade ritiene una bomba deflagrante (Timothy non è affatto guarito, oppure era guarito ma è stato così pazzo da reinfettarsi), e Deeks (che è la persona in questo momento più direttamente coinvolta nella salute di Timothy) non si scompone (perché non ha capito quello che il genio Lafeuillade ha invece capito benissimo, perché lui è intelligente e tutti gli altri sono dei cretini).

NdD: La serpe si è addormentata al sole di Sitges e ha fatto un bel sogno (per noi, un incubo).

Tu come la interpreti?

[Dora]

From a courtesy of Jules Levin.


From Discussion with study author:

The presentation at the Sitges Resist Wksp is getting attention and the interpretation by some appears to be controversial, so this report is intended to capture the facts.

• "We applied a series of measurements of HIV persistence to the study of the “Berlin Patient,” who has achieved an apparent cure after a hematopoietic stem cell transplant from a donor who was homozygous for the CCR5 delta-32 deletion. Our objectives were: (1) to determine if HIV had been fully eradicated as a consequence of the transplant; and (2) to define the potential role of various reservoir measurements in cure research."

The study results reported, as with all studies, are open to interpretation by anyone, so you might hear other interpretations, some of which may get the facts of the studies correct but interpret the findings as they choose, while others may get the facts incorrect. Some observers may interpret the results as false positives (due to contamination), while others may believe they are true positives. However, this study is the first planned in a series to try to understand exactly what is the case with the Berlin patient. The purposes of this study, as told to me by one of the investigators, Steven Yukl, were to see if they could detect any virus and to better understand the roles and limits of various measurements in evaluating potentially curative interventions. The Berlin Patient could have noninfectious HIV, which would be a "sterilizing cure", or it could be that some of it is infectious but his immune system is resistant to infection and/or controls the virus. The Berlin patient had 97% CCR5-dependent virus before the transplant & the the donor cells do not produce CCR5, so even if he has some residual virus, most of it would be unable to infect his donor immune system even if it were "infectious" to another person. Yukl said it's also possible there was contamination associated with the assays and that there is no HIV present; the findings reported from this study are inconclusive. But these researchers plan to continue studying this to try to find out if the Berlin patient received a sterilizing cure or if the immune system he has is controlling HIV, which we would be called a "functional cure".

The facts are that 3 labs were able to detect HIV sequence from 2 different sites (plasma and gut) at 4 different time points, but no sequence data are available from any of these samples. some or all of them could be real, or they could all be false positives from contamination. if "real," i think that the virus is more likely to be noninfectious, as only a small percentage of HIV is fully infectious, and 2 labs were not able to detect any infectious virus in co-cultures from blood cells. however, it is worth noting that the co-cultures assess for infectious virus from blood cells (where HIV was not detected in the quantitative PCR assays) rather than plasma or gut (the places where HIV was detected in the PCR assays), and that the culture assays to detect infectious virus are much less sensitive than the quantitative PCR assays. he could certainly have intermittent production of very low levels of virus, and it could even be infectious R5 virus, which would not be expected to able to infect his donor immune system, or (much less likely) infectious X4 virus that is controlled by his immune system before it has a chance to spread. the bottom line is that we can't be certain that the detectable HIV is real, and we don't know whether all of it is noninfectious or whether some of it could be relication-competent. additional studies are needed. however, he is still able to control virus without medicines ("functional cure"), and he may still have had a "sterilizing cure" (no infectious virus), so i think he is still an example of a very successful treatment.


From poster:

Results (Summary)

• •CD4+ T cell counts remained fairly stable and within the normal range (Figure 2).
  •In plasma, HIV RNA was detected in 2 (of 4) labs from 3 different time points (Table 1).
  •No HIV DNA or RNA could be detected in PBMC (4 and 3 labs, respectively; Table 2-3).
  •No replication-competent virus could be detected in 2 labs with extensive experience with co-cultures, even with 1.4 billion CD4+T cells from leukapheresis (Table 4).
  •HIV DNA was detected in the rectum in 1 lab (Table 5).
  •No HIV could be detected in CSF (2 labs) or in cells circulating in CSF (1 lab) (Table 6).
  •Three different labs detected HIV (2 from plasma, 1 from gut) at 4 different time points. Levels were lower than typical ART-suppressed patients (Table 7) and close to the limit of the most sensitive assays. Sequence data are not available from plasma or gut.
  •Two labs cloned and sequenced HIV from PBMC. However, these sequences bear little resemblance to each other or the pre-transplant variant, and one of the two sequences exhibits near perfect homology to a common lab strain, suggesting contamination.
  •HIV-specific Ab levels were readily detectable but tended to decrease over time (Figure 3).

Summary from slides

• 1) Most assays for HIV were negative:
  –No HIV DNA or RNA was detected in PBMC
  –No infectious virus was isolated from peripheral CD4+T cells
  –No HIV was detected in CSF fluid or cells
  –
  2) However, 3 different labs were able to detect HIV (2 from plasma, 1 from gut) at 4 different time points:
  –Levels were lower than typical ART-suppressed patients and close to the limit of the most sensitive assays.
  –Sequence data are not available from plasma or gut.
  –
  3) HIV-specific Ab levels were readily detectable, but detuned assays tended to show a decrease in Ab over time.

From poster:

Conclusions

• •Reconstitution with an R5-resistant but effective immune system has led to viral control ("functional cure") and possibly eradication of replication-competent HIV ("sterilizing cure"), although the intermittent detection of low-level virus raises the possibility that there has not been complete eradication.
  •The collective data suggest alternative possibilities: (1) the 4 positive samples may be false positives due to PCR contamination at the extreme limits of assay sensitivity; or (2) HIV DNA may persist in tissue if not blood cells, and the infected cells may make HIV RNA that can be intermittently detected in plasma.
  •Given the nature of the transplant, it is theoretically possible that any persistent virus will be found in non-T cell populations.
  •The gradual decline in HIV-specific Ab suggests a slow loss of host Ab-producing cells and lack of progressive infection of the R5-resistant donor immune system.
  •The combination of plasma, blood, and mucosal measures of HIV nucleic acid may not be sufficient to prove or disprove cure. Other measures, including HIV antibody levels, may be required.

Conclusions from slides:

• 1) Reconstitution with an R5-resistant immune system has led to viral control ("functional cure") and possibly eradication of infectious HIV ("sterilizing cure"). However, the intermittent detection of low-level virus makes it impossible to conclude definitively that a full cure was achieved.
  
  2) The collective data suggest alternative possibilities:
  A. The 4 positive samples may be false positives due to PCR contamination at the limits of assay sensitivity
  B. HIV DNA may persist in tissue if not blood cells, and these infected cells may make HIV RNA that can be intermittently detected in plasma.
  Further corroboration requires sequencing.
  
  3) Given the nature of the transplant, it is theoretically possible that any persistent virus will be found in non-T cell populations.

BACKGROUND from poster:

Background

• We applied a series of measurements of HIV persistence to the study of the “Berlin Patient,” who has achieved an apparent cure after a hematopoietic stem cell transplant from a donor who was homozygous for the CCR5 delta-32 deletion. Our objectives were: (1) to determine if HIV had been fully eradicated as a consequence of the transplant; and (2) to define the potential role of various reservoir measurements in cure research.

Case Report (Figure 1)

• Pre-transplant
  •Heterozygous for CCR5Δ32
  •HIV for ≥10yrs (on ART for 4 yrs) prior to diagnosis of AML (FAB M4). 2.9% X4 or dual-tropic
  
  Transplant (Hutter et al NEJM 2009):
  •Feb 2007: Treated with chemo, total body irradiation (TBI), conditioning (ATG, cyclosporin, mycophenolate), and allogeneic stem cell transplant (SCT) (day 0) from HLA-matched, homozygous CCR5Δ32 donor.
  •Achieved 100% chimerism.
  •ART stopped at time of transplant
  •AML relapsed; treated with chemo, TBI, and second allogeneic SCT (March 2008) from the same donor
  
  Post-transplant studies (Hutter et al NEJM 2009; Allers et al Blood 2011):
  •HIV RNA undetectable in plasma (45mo) and CSF (17 mo)
  •HIV DNA undetectable in PBMC (45mo), bone marrow (40mo), brain (17mo), and colon (29 mo)
  •Loss of HIV-specific T cell responses
  •Loss of Ab to Pol and Gag but not Env
  •Increase in peripheral and colonic CD4+T cell numbers to ≥ normal (24mo)
  •No CCR5 expression or wild type gene in colonic CD4+T cells (24, 29mo)
  •CCR5 detected on colonic macrophages at 5.5 mo but not at 24-29mo.
  •No CCR5 expressed in liver (12mo) or brain (17mo)

Study Rationale and Hypotheses

Several theoretical reasons suggest HIV might persist or recur, including:

• •Presence of X4 variant prior to transplant
  •After transplant, his CD4+ T cells could be infected ex vivo with X4 (but not R5) virus
  •Presence of CCR5+ target cells post-transplant (5.5 mo)
  •Possibility of long-lived HIV reservoirs or CCR5+ cells not susceptible to conditioning

Hypotheses:

• •HIV may persist in rare long-lived cells in tissues that are more resistant to chemo, radiation, and graft-replacement.
  •Latent R5 virus may be intermittently expressed at low levels, but will likely not be able to establish a spreading infection.
  •If X4 virus persists, it may eventually emerge and spread.

Methods

• Procedures to obtain specimens included multiple large volume blood draws, leukapheresis, flexible sigmoidoscopy with biopsies from rectum (30 biopsies), and a lumbar puncture.
  Samples (plasma, PBMC, gut, CSF) were sent to 6 different labs with expertise in detecting extremely low levels of virus: (1) Blood Systems Research Institute (Michael Busch), (2) NIH (Tae-Wook Chun), (3) Solna, Sweden (Sarah Palmer), (4) UCSD/VASD (Doug Richman), (5) Johns Hopkins (Robert Siliciano), and (6) UCSF/SFVAMC (Joseph Wong).
  
  Cell-associated HIV DNA in PBMC was measured in 4 labs using qPCR or digital droplet PCR.
  Plasma HIV RNA was measured in 4 different labs using different techniques: (1) Roche AmpliPrep assay, (2) Single Copy Assay (SCA), (3) Transcription-Mediated Amplification (TMA), and (4) modified Abbott assay that involves pelleting virus from 30ml of plasma.
  Cell-associated HIV RNA in PBMC was measured in 3 labs using qRT-PCR or TMA.
  Latently-infected peripheral CD4+ T cells (in infectious units per million cells, IUPM) were measured in 2 labs by co-culture.
  Cell-associated HIV DNA and RNA were measured from both bulk rectal biopsies and collagenase-digested rectal cells in 1 lab using qPCR and qRT-PCR.
  Cell-free HIV RNA in CSF was measured in 2 labs; 1 lab also measured HIV DNA in CSF cells
  Blood and gut cells were also sent for various immunology studies, including CD4/CD8 T cell counts, markers of T cell activation, coreceptor usage, HIV-specific T cell responses, and levels of HIV-specific antibodies.