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Separo un post scritto un anno fa nel thread K.Collins_Staminali come reservoir, APOBEC3G e altro ancora, perché di CD4 memoria che hanno caratteristica di cellule staminali e che possono costituire un reservoir dell'HIV sentiremo parlare molto la prossima settimana al CROI - Mathias Lichterfeld terrà infatti una relazione dedicata alle T Memory Stem Cells: The Stem Cell Reservoir for HIV?
Al post di un anno fa aggiungo solo l'informazione che Buzon, Lichterfeld e colleghi di Harvard hanno pubblicato proprio di recente su Nature una "breve comunicazione" dedicata a questa ricerca (HIV-1 persistence in CD4+ T cells with stem cell–like properties - il cui full text è reperibile in Natap). Quando l'ho letta l'estate scorsa, però, avevo deciso di non parlarne qui, perché mi pare che non racconti nulla di più di quanto spiegato al CROI l'anno scorso.
Nel prossimo post ne farò una brevissima sintesi. E poi aspettiamo il CROI.

Dora ha scritto:Riprendo un discorso iniziato e subito interrotto circa un anno fa in questo thread, per introdurre la presentazione al CROI di Maria Buzon, Rangon Institute, MIT, Harvard, perché il mentore di Buzon è proprio quel Mathias Lichterfeld che è uno dei pionieri dello studio di questi strani linfociti T memoria, che si comportano come cellule staminali.

Dora ha scritto:un altro dei 4 finanziamenti [amfAR] è per Mathias Lichterfeld, del Massachusetts General Hospital, che "will investigate whether a newly discovered subset of CD4 T cells that have properties similar to stem cells might serve as the main site of viral persistence as well as a source of virus that re-emerges when ART is stopped".

Dora ha scritto:Dato che 'sta cosa delle T memory stem cells per me è una novità assoluta, ho cercato un po'. Non ho trovato lavori di Lichterfeld sull'argomento, né nulla che le descriva come un altro reservoir; ho però trovato un breve articolo del 2008 di un onco-ematologo - Stephen G. Emerson - che mi sembra sia il primo a parlarne: T Memory Stem Cells: Looking For Stem Cells In An Immune Haystack.

T Memory Stem Cells Are a Long-term Reservoir for HIV-1

Sappiamo che anche se la ART sopprime la replicazione virale in modo efficace, l’HIV persiste – prevalentemente nei CD4 latentemente infetti , in cui si trova in uno stato di latenza che lo rende irraggiungibile dagli antiretrovirali.

Tuttavia, non tutti i CD4 – dice Buzon – sono creati uguali; alcuni costituiscono una nicchia particolarmente adatta a consentire la persistenza dell’HIV.
Quel che sappiamo della differenziazione dei linfociti T è che quando una cellula naive incontra un antigene, mediante una cellula che presenta l’antigene, quella cellula entra in un processo di differenziazione, che culmina nella generazione di cellule effettore che hanno una breve vita. Quando il segnale dell’antigene cessa, questa cellula va in uno stato di quiescenza, entrando nel serbatoio di cellule memoria.

Di recente, è stato individuato un nuovo tipo di linfociti T memoria, che hanno delle caratteristiche molto particolari, che li apparentano alle cellule staminali: le staminali T memoria (Tscm).

• Anzitutto, questi Tscm hanno una vita lunghissima. Inoltre:
• costituiscono il sottinsieme meno differenziato di cellule memoria (Tna → Tscm → Tcm → Tem).;
• vengono mantenute in essere da proprietà simili a quelle delle staminali, come la capacità di auto-rinnovarsi e di proliferare omeostaticamente;
• hanno una capacità proliferativa maggiore rispetto alle altre cellule memoria e sono in grado – se stimolate da un antigene - di indurre una generazione de novo di tutti i sottogruppi dei linfociti T memoria e effettori;
• il loro fenotipo le identifica come un nuovo sottogruppo a sé stante (CD45RA, CCR7, CD62L, CD28, CD27, CD127, CD122, CD95).

La domanda è dunque se queste cellule possano costituire un reservoir dell’HIV e la risposta è sì.

I CD4+ Tscm, infatti, possono essere infettati dall’HIV-1 sia in vitro, sia ex vivo:

Ma c’è di più, perché si è visto che queste cellule sono quelle - ex vivo – più suscettibili di essere infettate da diversi ceppi di HIV-1:

Il passo successivo era di dimostrare che i CD4+ Tscm possono costituire un reservoir in vivo dell’HIV-1 ed è quello che Buzon dimostra, prelevando campioni di CD4 da pazienti in ART da una media di 8 anni e misurando i livelli di HIV DNA intra-cellulare. Quello che è emerso è che i Tscm, confrontati con tutti gli altri sottogruppi di CD4, avevano i più alti livelli per cellula di HIV DNA.

Calcolando il contributo medio di questi Tscm all’intero reservoir, si è visto che ammontava a circa l’8%: basso, rispetto alle altre cellule, ma perché la frequenza dei Tscm ammonta a circa l’1% di tutti i CD4.

Facendo uno studio longitudinale, si è anche visto che i livelli di DNA virale nei Tscm erano costanti nel tempo, a indicare la persistenza e la lunga durata di questo reservoir.

Mettendo insieme i dati di pazienti diversi, si è vista la frequenza dei Tscm su tutti i CD4 (circa 1%) e il loro contributo al reservoir dei CD4 dopo un periodo breve e dopo un periodo lungo di ART (da 5 a 19%, a conferma che queste cellule hanno una vita molto lunga).

È stata poi studiata la capacità del virus contenuto nei Tscm di replicarsi, e si è visto che è capace di replicazione. Inoltre, l’analisi filogenetica ha mostrato identiche sequenze fra i Tscm dopo 4 fino a 8 anni di ART, sempre a indicazione della lunga vita di questo reservoir.

Nella comunicazione a Nature in cui descrivono la persistenza dell’HIV-1 in linfociti T CD4+ con proprietà di simil-staminali, Lichterfeld, Buzon e colleghi spiegano che

Il comparto dei CD4 memoria comprende i CD4 memoria centrali (Tcm), che hanno una lunga vita e che subiscono un programma di sviluppo sequenziale, che li vede sempre più evolversi in cellule più differenziate, che hanno vite molto più brevi: i CD4 memoria effettori (Tem) e i CD4 terminali (terminalmente differenziati).

L’esistenza di una popolazione di linfociti T memoria più immaturi, con caratteristiche simili a quelle delle staminali (Tscm), prima è stata ipotizzata sulla base di studi su animali e poi è stata confermata negli uomini, nei topi e nelle scimmie. Queste cellule costituiscono il più primitivo e duraturo stadio evolutivo dei CD4 memoria e possono differenziarsi in Tcm, Tem e T terminali pur continuando a rifornire il loro proprio serbatoio, auto-rinnovandosi mediante un processo di omeostasi.

L’ipotesi da cui sono partiti Lichterfeld e colleghi è che l’HIV possa utilizzare questi Tscm come nicchia preferenziale per continuare a persistere per un tempo molto lungo.

Gli esperimenti fatti per confermare questa ipotesi sono raccontati nel post precedente e i risultati sono sintetizzati nell'ultima diapositiva.

Le conclusioni dello studio sono che i CD4 Tscm, nonostante la loro sostanziale rarità, sono un sottoinsieme a sè stante dei CD4 memoria e costituiscono la popolazione cellulare in cui la persistenza dell’HIV ha una durata più lunga che in altre sottopopolazioni di linfociti T memoria ed è più evidente, probabilmente a causa del programma cellulare intrinseco a queste cellule, che imprime in loro una maggiore capacità di auto-rinnovarsi, di resistere all’apoptosi e di sopravvivere per lunghissimi periodi di tempo.

Poiché di recente si sono osservate proprietà di simil-staminali anche in certi sottoinsiemi di CD4 effettori (nei Th17), bisognerà analizzare la persistenza dell’HIV anche in queste popolazioni di cellule.
Inoltre, bisognerà determinare se un piccolo reservoir nei Tscm rappresenti una caratteristica che distingue l’infezione NON patogenica da SIV nelle scimmie che ne sono ospiti naturali, così come si è dimostrato nei CD4 memoria centrali.

L’inibizione farmacologica dei meccanismi molecolari specifici delle staminali è studiata attualmente in campo oncologico. C’è dunque la possibilità che, se si interviene farmacologicamente sui CD4 Tscm, si possa in qualche modo diminuire, se non distruggere del tutto, questo reservoir dell’HIV. Questo, naturalmente, all’interno di una strategia di eradicazione e di cura.

Ieri al CROI, durante il simposio “Toward a Cure: A Challenging Game of Hide and Seek”, Mathias Lichterfeld, Massachusetts General Hospital, Boston, ha tenuto una lezione sui CD4 memoria che hanno caratteristica di staminali e costituiscono un nuovo reservoir dell’HIV.
Purtroppo le slides non sono disponibili (forse perché Lichterfeld fa riferimento a due presentazioni - quella di Silvestri e quella di Rasmussen - che non si sono ancora tenute e sono sotto il solito maledettissimo embargo del CROI), quindi per adesso questi sono i miei appunti di una lezione che, a mio parere, è stata davvero bella.

Immagine

T Memory Stem Cells: The Stem Cell Reservoir for HIV?

La domanda da cui è partita la ricerca è la solita di tutti quelli che studiano la localizzazione dei reservoir: dove persiste l’HIV in presenza di ART che sopprime la viremia sotto la soglia di rilevabilità dei test standard?
Il reservoir dei CD4 memoria è quello per il quale esistono più dati, ma non tutti i linfociti T sono creati uguali e nell’ultimo paio di anni si è scoperto che esiste una estrema diversità ed eterogeneità nei CD4 e che questo è particolarmente vero per i CD4 memoria. Sono cellule che partono da uno stadio estremamente immaturo, con differenziazione minima e durata lunghissima e poi maturano, differenziandosi sempre più e sempre più essendo suscettibili di apoptosi (morte cellulare).
Ai primissimi inizi del processo di differenziazione di queste cellule memoria, esiste una popolazione di cellule molto rare (circa il 2-4% di tutti i CD4), che presentano delle caratteristiche funzionali molto simili a quelle delle cellule staminali – hanno cioè la capacità di persistere per tempi molto lunghi e una fortissima attività proliferatrice, con la proliferazione che può verificarsi in due direzioni differenti:

1. verso uno stadio più maturo e differenziato, quello dei CD4 memoria transitori;
oppure
2. attraverso un processo di proliferazione omeostatica, mantenendo il fenotipo e le funzioni originali.

Questa capacità di proliferare in due modi diversi è una proprietà caratteristica delle staminali ed è la ragione per cui queste cellule sono state chiamate linfociti T memoria staminali.

Lichterfeld e il suo gruppo di ricerca ritengono che la forte attività proliferatrice di queste cellule, che le rende capaci di ripopolare continuamente l’intero serbatoio di cellule memoria, le renda anche particolarmente suscettibili ad essere infettate dall’HIV in modo latente. E quando una di queste cellule è infetta, essa prolifera creando una intera progenie di cellule infette, rigenerando continuamente il serbatoio di cellule infette e contribuendo a spiegare la persistenza dell’HIV in presenza di ART. Questo a differenza per esempio dei CD4 memoria effettori che, quando sono infetti, non hanno grandi capacità proliferative quindi, morendo, bloccano l’infezione.

Lichterfeld ha dunque indagato i livelli di HIV DNA in alcuni pazienti in ART da una mediana di 8 anni dopo aver separato le diverse popolazioni di CD4 memoria e in tutti i pazienti ha trovato livelli piuttosto alti di DNA virale nei Tscm.
Ora, i Tscm sono pochi, quindi non offrono un contributo quantitativamente importante al reservoir dell’HIV. Ma data la loro durata lunghissima e la loro capacità di autorinnovarsi, giocano certamente un ruolo rilevante.

Infatti, l’analisi del DNA virale in 9 pazienti entrati in terapia in fase acuta e che hanno continuato la ART per molti anni ininterrottamente, avendo dunque un reservoir particolarmente ridotto, ha proprio dimostrato che esisteva un reservoir nei Tscm e che i livelli di DNA virale diminuivano molto più lentamente in queste cellule che in tutti gli altri CD4 memoria più differenziati.

L’analisi filogenetica su sequenze di virus isolate in tempi diversi nello stesso paziente è stata fatta per comprendere meglio il ruolo dei Tscm e ha dimostrato che le sequenze erano strettissimamente connesse, quindi che il comparto dei Tscm, insieme a quello dei CD4 memoria centrale, è quello che ha la durata più lunga.

Lichterfeld ha poi raccontato che Guido Silvestri gli ha fatto avere dei dati sui macachi rhesus e sui sooty mangabeys, che mostrano come nei sooty mangabeys, ospiti naturali dell’SIV, che non hanno progressione di malattia nonostante viremie altissime, i Tscm siano sostanzialmente ridotti rispetto ai macachi, che non sono ospiti naturali e hanno una progressione dell’infezione simile a quella umana. E questo vale solo per questo comparto di CD4 memoria, perché tutti gli altri presentano strette analogie fra le due specie di scimmie.
Le scimmie di Silvestri non erano in terapia, perché venivano studiate per capire la patogenesi dell’infezione. Quel che si è visto è che l’SIV DNA era ridotto in tutti i comparti dei CD4 dei sooty mangabeys e nella maggior parte dei Tscm il DNA virale non era rilevabile. A differenza dei macachi, che avevano tutti livelli rilevabili di vDNA nei Tscm.

Questo porta a due conclusioni:

1. che i Tscm dei sooty mangabeys devono avere qualche caratteristica che li protegge dall’SIV;
2. e che l’assenza di un grande reservoir nei Tscm si associa con la capacità di resistere all’SIV e quindi con una lenta o nulla progressione della malattia, costituendo una caratteristica unica dell’infezione da SIV non patogenica in primati non umani.

Se si osservano i linfociti T dal punto di vista della loro funzionalità, classificando i CD4 in base alla loro polarizzazione funzionale come Th1, Th2, Th17, Treg e Th follicolari e ricordando che tutti questi sottoinsiemi hanno una funzione diversa nella difesa immune contro i microbi, ci si può chiedere se questa polarizzazione funzionale influenzi la capacità dei linfociti T di servire come reservoir a lungo termine dell’HIV. Si sa infatti che la polarizzazione funzionale dei CD4 influenza anche il loro profilo evolutivo (per esempio i CD4 naive si possono evolvere in Th1, e i Th1 rappresentano una breve fase per i CD4 memoria effettori; invece i Th17 hanno una vita molto più lunga, maggiori capacità di auto-rinnovamento e di proliferazione omeostatica).

Lichterfeld ha dunque isolato CD4 con differenti polarizzazioni da alcuni pazienti in ART e ha analizzato il contributo dato da questi diversi sotto-insiemi al numero totale dei CD4 memoria e al reservoir nei CD4. E quel che ha visto è che i Th2 danno un grandissimo contributo al serbatoio complessivo dei CD4, ma al tempo stesso danno un contributo molto più piccolo al reservoir dell’HIV nei CD4. Pare dunque che i Th2 abbiano una ridottissima capacità di servire come reservoir di lunga durata.
Al contrario i Th17 sono molto pochi, ma danno un grande contributo al reservoir, perché hanno una durata molto maggiore (e infatti costituiscono la maggior parte del reservoir in persone in terapia da molti anni e il loro ruolo nel reservoir aumenta nel tempo, mentre nei pazienti in terapia da poco si vedono tanti Th1 contenenti DNA virale).

La conclusione è che questo confermi l’ipotesi che la polarizzazione funzionale dei CD4 influenzi la capacità di queste cellule di servire come reservoir.

L’ultima parte della lezione è stata dedicata alla manipolazione e distruzione del reservoir mediante HDACi.
In particolare, Lichtenfeld fa riferimento al trial danese sul panobinostat: somministrazione dell’HDACi un giorno sì e uno no, tre volte a settimana, per un mese in presenza di ART, seguita da analisi degli effetti virologici e immunologici del farmaco sul reservoir dei CD4. Indagando che cosa il panobinostat abbia fatto al DNA virale associato alle cellule, Rasmussen ha visto che l’HDACi ha avuto l’effetto di riattivare del virus latente. Nei 15 pazienti che hanno partecipato allo studio si è visto un iniziale declino dell’HIV DNA nelle prime due settimane, ma poi purtroppo questo processo si è bloccato. Se però si va a indagare paziente per paziente, si vedono 11 pazienti con livelli di DNA virale molto stabili, mentre 4 pazienti hanno mantenuto nel tempo il declino dell’HIV DNA associato ai CD4.

Lichterfeld riconosce che questa è una analisi retrospettiva e che le conclusioni che si possono trarre da una analisi post hoc sono limitate, ciò nondimeno distinguere fra i due tipi di pazienti e capire in quali sottopopolazioni di CD4 memoria si è avuto un maggior declino di HIV DNA può offrire una migliore comprensione sulle dinamiche del reservoir. Quel che si è visto è che non è accaduto granché nella popolazione complessiva dei CD4, anzi nei non responder si è visto addirittura un aumento del reservoir dei CD4 memoria centrali (mica tanto bello, perché c’è stato un aumento delle cellule che vivono a lungo a scapito di quelle, come i CD4 memoria effettori, che almeno si tolgono di torno rapidamente); invece, nei pazienti che hanno risposto meglio il declino del DNA virale è avvenuto soprattutto nei CD4 memoria centrali – e questo passaggio dalla prevalenza nel reservoir di cellule con una lunga vita a cellule che muoiono in fretta è ovviamente un ottimo segno.
I Tscm sono stati analizzati solo in due pazienti, quindi i dati non sono indicativi.

Da che cosa dipenda la variabilità nella risposta al panobinostat è ancora da indagare (e speriamo che Rasmussen domani ci dica qualcosa di più).

[divbox]P.S. Solo per ricordare quanto questa sottopopolazione di CD4 possa essere importante e possa far fallire i tentativi di eradicazione se non viene adeguatamente distrutta: secondo il report di Gus Cairns sul "community cure workshop" che si è tenuto subito prima del CROI, Maria Buzon avrebbe dichiarato che "the hidden HIV that may still have existed in the Boston patients may be located in so-called T-memory stem cells".[/divbox]

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CD4 memoria con caratteristica di staminali: nuovo reservoir

CD4 memoria con caratteristica di staminali: nuovo reservoir

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