SILICIANO: caratterizzazione del reservoir, studi sulla cura

[nordsud]

Ma porco mondo perchè non prendono il primo hiv+ che passa per strada alcolizzato fin sopra i capelli e lo imbottiscono di Antabuse? Anzi.. perchè qualche anima bella degli alcolisti anomimi e positivi non si imbottisce per conto suo di Antabuse ? Ma dai che sciocco.. essendo anonimi resta anche anonimo il risultato.
Dora mi scuso per questo acido sarcasmo. Continua a tenerci aggiornati.

[uffa2]

Ma porco mondo perchè non prendono il primo hiv+ che passa per strada alcolizzato fin sopra i capelli e lo imbottiscono di Antabuse? Anzi.. perchè qualche anima bella degli alcolisti anomimi e positivi non si imbottisce per conto suo di Antabuse ? Ma dai che sciocco.. essendo anonimi resta anche anonimo il risultato.
Dora mi scuso per questo acido sarcasmo. Continua a tenerci aggiornati.

Devo dire che, in tutta onestà, neppure io capisco cotante cautele per un farmaco vecchio di sessant'anni, i cui profili di si curezza dovrebbero essere ben più che conosciuti: o c'è qualcosa che non li convince (magari proprio per il profilo di sicurezza), oppuer che accidenti aspettano? credo che ci sarebbero un bel po' sieropositivi astemi pronti ad assumere il farmaco in questione...

[Dora]

Dora mi scuso per questo acido sarcasmo.

No problem: non ho un ego così ipertrofico da non riuscire a distinguere il sarcasmo rivolto a me da quello rivolto ad altri.

Ma porco mondo perchè non prendono il primo hiv+ che passa per strada alcolizzato fin sopra i capelli e lo imbottiscono di Antabuse? Anzi.. perchè qualche anima bella degli alcolisti anomimi e positivi non si imbottisce per conto suo di Antabuse ? Ma dai che sciocco.. essendo anonimi resta anche anonimo il risultato.

Devo dire che, in tutta onestà, neppure io capisco cotante cautele per un farmaco vecchio di sessant'anni, i cui profili di si curezza dovrebbero essere ben più che conosciuti: o c'è qualcosa che non li convince (magari proprio per il profilo di sicurezza), oppuer che accidenti aspettano? credo che ci sarebbero un bel po' sieropositivi astemi pronti ad assumere il farmaco in questione...

Capisco la vostra obiezione, ma questi stanno a misurare le variazioni infinitesimali del reservoir in persone con viremia azzerata dalla ART, quindi fanno una cosa che non era tecnicamente neppure immaginabile anche solo pochi anni fa (come ricorda Uffa, il disulfiram esiste da tempo immemorabile, dagli anni '20 addirittura, e già nel '99 a qualcuno era venuto in mente di provarlo in persone con HIV più o meno come state dicendo voi. Un trial finito in niente, a quanto mi sembra di capire).

A me i conti sul disulfiram non tornano per una ragione tutta interna al trial: perché al CROI, sia pure a denti strettissimi, Deeks & co. avevano ammesso che i risultati sul reservoir erano - a usare un eufemismo - piuttosto modesti e non avevano minimamente raggiunto una significatività statistica.
L'unica ragione che mi do di questa insistenza a continuare, quindi, è che la riattivazione in vivo del virus latente era modesta, sì, ma non nulla e, a fronte della miseria di risultati sul versante eradicazione, è sempre qualcosa contro niente. Insomma, non vorrei che stessero cincischiando come è stato fatto per il vaccino thai, perché il 30% non era zero.

Tenete però conto che è una sperimentazione pensata e sponsorizzata da Siliciano quindi, prima di considerarla fuffa, io devo proprio sbatterci la faccia contro.

Comunque sia, il trial di cui allora portarono dei risultati parziali adesso dovrebbe essere in via di completamento (Estimated Study Completion Date: June 2012; Estimated Primary Completion Date: June 2012 [Final data collection date for primary outcome measure]) e ho visto che ce n'è un altro in atto, sempre della University of California, San Francisco, per studiare le interazioni fra disulfiram e efavirenz, o atazanavir, o ritonavir (molto strano che studino le interazioni con il norvir, perché contiene alcool e si sa da mo' che non deve essere preso insieme al disulfiram). Forse si stanno portando avanti?

[Dora]

Lo segnalo qui anche se non è un lavoro soltanto di Siliciano, perché si tratta di una ricerca cui lui ha partecipato e che potrebbe offrire una nuova strategia contro i reservoirs. È davvero difficile e in fase iniziale, quindi mi limito a riprendere il comunicato stampa.

È pubblicato nella "early edition" del 21 gennaio di PNAS che non è ancora online (*), ma la Johns Hopkins University ha emesso un comunicato stampa qualche giorno fa relativamente a un lavoro firmato da James Stivers, farmacologo e biologo molecolare, da Robert Siliciano e da vari altri scienziati. Si tratta di una ricerca in cui è stato decodificato un sistema che rende certi tipi di cellule immunitarie resistenti all'HIV. Interagiscono due diverse componenti: alti livelli di una molecola che si incorpora nel DNA virale come “un codice scritto in inchiostro invisibile” e un enzima che, quando legge questo codice, invece di riparare il DNA lo tagliuzza in tanti pezzettini inutilizzabili.

Il codice del DNA è composto di quattro blocchi, i nucleotidi. Prima che una cellula si divida, gli enzimi che copiano il DNA legano insieme questi nucleotidi sulla base di modelli preesistenti in modo che ciascuna nuova cellula riceva la propria copia del genoma. Capita però talvolta che l’enzima commetta un errore e copi un nucleotide dove non dovrebbe. Per evitare questi errori, molte cellule umane usano un altro enzima che “rompe” i blocchi, lasciando dei buchi che poi, a loro volta, vengono riparati da altri enzimi.

Alcune cellule immunitarie, quando sono in stato di quiescenza, sono prive di questo meccanismo di controllo perché, dal momento che non stanno replicando il loro DNA, quel tipo di enzima non serve.

Quando un retrovirus come l'HIV invade una cellula, come prima cosa forma una copia di DNA del proprio genoma e la inserisce nel genoma della cellula ospite. Se questo accade in presenza dell’enzima “controllore”, l’enzima subito si attiva e “rompe” il DNA del virus integrato nel genoma. A sua volta, arriva un altro enzima a riparare il buco.



Quello che hanno scoperto nel laboratorio di Stivers è che tutto questo processo non vale per le cellule quiescenti, in cui il DNA danneggiato non viene riparato e rimane tutto bucherellato. In sostanza, così danneggiato da non poter funzionare. “È come sganciare una bomba nucleare sul genoma virale” – dice Stivers.
Perché questa scoperta è interessante? Perché gli antiretrovirali sopprimono la replicazione del virus, ma quando questo è latente in una cellula quiescente non riescono neanche a vederlo. Quindi il meccanismo individuato dai ricercatori della Johns Hopkins potrebbe permettere di costruire un farmaco che sfrutti questa via per diminuire il serbatoio di virus che si nasconde nelle cellule che non si dividono perché sono in quiescenza.




(*) Ora l'articolo è online: Uracil DNA glycosylase initiates degradation of HIV-1 cDNA containing misincorporated dUTP and prevents viral integration

• These findings suggest that dUTPase inhibitors might be a useful strategy to increase protection of CD4+ T cells. The therapeutic index of this approach would depend on the ability to specifically direct uracil into the replicating virus while preserving the integrity of the host genomic DNA (i.e., the relative rates of DNA replication of the viral and human polymerases and the effectiveness of nuclear uracil base excision repair in removing nascent uracils from host genomic DNA). The viral DNA, which is rapidly synthesized in the cytoplasmic compartment, would likely accumulate a much larger total uracil load and be subject to fragmentation on entry into the nuclear compartment, whereas the slowly replicating nuclear DNA would accumulate less uracil and be repaired.

[Dora]

Siliciano ha tenuto oggi al CROI una lezione plenaria STRAORDINARIA sulle strategie di eradicazione. Conto di scriverne nei prossimi giorni, magari creando un thread a parte nella sezione "Notizie dai Congressi".
È invece appena stato reso disponibile l'abstract di un lavoro che credo sia la continuazione della ricerca presentata al seminario su cura ed eradicazione a margine di AIDS 2012, di cui abbiamo parlato l'estate scorsa e che non è ancora stato pubblicato, ma che dimostra che il reservoir di virus latente, capace di riattivarsi e di replicarsi, è più grande di quanto si pensasse e può costituire un ostacolo ai tentativi di eradicazione.
Per ora non lo traduco. Magari fa come ha fatto l'anno scorso e fa uscire l'articolo in concomitanza del CROI.


Characterization of Non-induced HIV-1 Proviruses Dampens the Hope for HIV-1 Eradication - Paper #43

Ya-Chi Ho*1, L Shan1, J Wang2, N Hosmane1, J Blankson1, and R Siliciano1,3

1Johns Hopkins Univ Sch of Med, Baltimore, MD, US; 2Louisiana State Univ Hlth Sci Ctr Sch of Med, New Orleans, US; and 3Howard Hughes Med Inst, Chevy Chase, MD, US


Vedere messaggio successivo. ↓

[Dora]

La presentazione di Ya-Chi Ho, la collaboratrice di Siliciano, è stata estremamente tecnica, senza però dire di più di quanto già non dicesse l’abstract. Quindi ho pensato di limitarmi a tradurre l’abstract e a postare alcune delle slides più significative, che illustrano quanto è lì sintetizzato.


Characterization of Non-induced HIV-1 Proviruses Dampens the Hope for HIV-1 Eradication

Background: Ripulire il reservoir latente dell’HIV-1 nei CD4 quiescenti dei pazienti in ART è una delle speranze attuali per l’eradicazione dell’HIV-1. Anche dopo avere massimizzato in vitro l’attivazione, soltanto 1 su 1 milione di CD4 quiescenti può essere indotto a rilasciare del virus capace di replicarsi. Tuttavia, 100-1000 su 1 milione di CD4 quiescenti ospitano dei provirus dell’HIV-1, la maggior parte dei quali non sono riattivati e si ritiene in genere che siano difettivi. Noi ipotizziamo che una proporzione significativa di questi non-indotti provirus dell’HIV-1, che non vengono riattivati in un singolo ciclo di attivazione massimizzata in vitro, siano in realtà capaci di replicarsi. Questa popolazione finora trascurata potrebbe di molto complicare i tentativi di eradicare.

Metodi: I CD4 quiescenti tratti da pazienti in ART soppressiva sono stati sottoposti a diluizione limitante in coltura, con attivazione massimizzata in vitro mediante fitoemagglutinina. Dopo 2 settimane, è stato usato un test ELISA della p24 per determinare la presenza di virus capaci di replicazione in ciascuna piastra. Usando una PCR nidificata per diluizione limitante, l’analisi della distribuzione di Poisson, sequenziamento di massa e sintesi dei geni, abbiamo ricostituito dei cloni completi di provirus non-indotti dalle cellule di piastre p24 negative e li abbiamo confrontati con cloni autologhi di virus completi ricavati da supernatanti di piastre p24 positive.

Risultati: Abbiamo trovato che il 14% dei provirus clonali non-indotti aveva cornici di lettura aperte (ORF – open reading frames) e l’83% di queste era capace di replicazione. La maggior parte dei provirus non-indotti aveva funzioni LTR intatte, sia di base, sia dopo la riattivazione. I provirus non-indotti si integravano di preferenza in introni di geni attivamente trascritti e privi di metilazione CpG sopra l’LTR. La percentuale di provirus che avevano ORF intatte presentava variazioni individuali, ma si correlava meglio con i test di sviluppo virale che con la quantificazione basata sulla PCR.

Conclusioni: Il nostro lavoro ha permesso di identificare un aumento del 12% nella dimensione del reservoir latente rispetto ai valori attesi basati sui test di coltura del virus. Questi provirus non-indotti, che mostrano di essere capaci di replicazione senza un evidente silenziamento epigenetico, rappresentano una minaccia dal punto di vista clinco e aumentano gli ostacoli a trovare una cura. La caratterizzazione di questi pro-virus non indotti spiega anche le discrepanze fra test di sviluppo virale e test di quantificazione basati sulla PCR nel misurare la dimensione del reservoir latente dell’HIV-1.

[uffa2]

40-50 volte più ampio dell'immaginato?
oh, queste sono le belle notizie che uno si aspetta

[Dora]

40-50 volte più ampio dell'immaginato?
oh, queste sono le belle notizie che uno si aspetta

Siliciano aveva iniziato a parlare di questa nuova mazzata l'estate scorsa. Io avevo trovato un commento di Margolis e l'avevo postato. Ora lo riposto, dato che sono passati dei mesi e siamo in una nuova pagina di thread, sottolineando la conclusione di Margolis, che mi pare abbastanza equilibrata: scoprire che il reservoir latente è più grande di quanto stimato, non dovrebbe mandarci tutti in depressione, perché continua in ogni caso ad essere piccolo. Quel che dobbiamo fare è, da un lato trovare una strategia antilatenza che funzioni, dall'altro dei modi più precise per misurare le dimensioni del serbatoio di cellule latentemente infette.

Non è come dirlo, lo so.

Finally, Siliciano discussed new and unpublished work from his laboratory.
An important issue in future attempts to cure HIV infection is the measurement of the size of the problem. The HIV genome, HIV DNA, can easily be measured in the cells of almost all HIV-infected patients, even those on ART for many years. However, in such patients, latent HIV is very rare, found in (often much) less than 1 in a million resting CD4+ T cells. Therefore most of these HIV DNA molecules are defective, “junk” DNA that cannot make virus and are not a threat. The problem is that hidden in the pile of junk are potentially deadly, functional genomes. As we move towards eradication therapies, we will need to know how much progress we are making.

So the Siliciano lab performed standard viral outgrowth assay of resting CD4 T cells, growing millions of cells in cultures of 1 million cells per dish. From some culture wells, replication competent HIV was recovered. But the lab looked for HIV DNA in the wells where virus was not recovered, and found viral DNA in some of these. Through exhaustive amplification and sequencing techniques, the lab tried to explain what was wrong with the DNA viral genomes that did not produce virus in culture. Most of these genomes were defective due to multiple and/or extensive mutations. But about 20% of the genomes appeared to be functional, at least on the level of the genetic sequence. When a few of these genomes were reintroduced in to cells in a way that they could produce viral particles, these viruses appeared to grow reasonably well. The take-home message of the work is that while simple measures of HIV DNA in cells wildly overestimate the size of the true latent reservoir, the precise and exhaustive viral culture assays that attempt to measure the latent reservoir may underestimate its size.

In my opinion is it not depressing to discover that the size of the latent reservoir may be two or even 5 times bigger than previously estimated, as in absolute numbers of infected cells, it is still pretty small. But if can we develop eradication therapies, we will need better tools to measure the size of the reservoir as we whittle it down. If we are successful, in the end we come to studies of treatment interruption as it is likely that there will always be some sort of HIV genetic material that can be detected in patients, as was recently reported with the only person likely cured so far, the Berlin patient Tim Brown.

[uffa2]

bah, se l'ampiezza è "solo" quantitativa ci può anche stare... però avrei preferito altro genere di notizie

[Dora]

Negli stessi giorni in cui Siliciano e il suo team presentavano al CROI la loro ricerca sull’utilità di stimolare reazioni citolitiche da parte dei linfociti T al fine di meglio eliminare le cellule in cui il virus è stato risvegliato dalla latenza, veniva pubblicato su Immunity l’articolo relativo a questo studio.
In buona parte ne ho già parlato dando conto dell’abstract e della relazione di Liang Shan, però credo che raccontare parti dell’articolo aiuti a capire meglio l’importanza di questa ricerca e dei suoi possibili sviluppi, anche perché pare riportare tutto il peso della reazione dell'ospite sull'immunità cellulare a scapito della reazione anticorpale (alla faccia dei vari Super-Anticorponi-Neutralizzanti, che un mese sì e uno no vengono spacciati come LA soluzione del problema).
(...)

Stimulation of HIV-1-Specific Cytolytic T Lymphocytes Facilitates Elimination of Latent Viral Reservoir after Virus Reactivation

(...)In questo studio, Siliciano ha

• 1. generato delle cellule latentemente infette a partire da CD4 primari;
  2. usato il SAHA (e in certi esperimenti anche il disulfiram) per riattivare l’HIV-1 latente nei CD4 quiescenti;
  3. scoperto che LA RIATTIVAZIONE DEL VIRUS NON COMPORTA DI PER SÉ LA MORTE DELLE CELLULE INFETTE: i CTL dei pazienti in HAART non sono riusciti ad uccidere i CD4 autologhi latentemente infetti dopo la riattivazione del virus latente;
  4. ipotizzato, quindi, che LA RIATTIVAZIONE DELL’HIV-1 LATENTE NON RIESCA A RIPULIRE IL RESERVOIR;
  5. dedotto che LA STIMOLAZIONE DI RISPOSTE CTL PRIMA DELLA RIATTIVAZIONE DEL VIRUS POSSA ESSERE UN PASSO ESSENZIALE PER L’ERADICAZIONE.

(...) In sostanza, la riattivazione del virus latente è soltanto il primo passo verso l’eradicazione: bisogna anche riuscire ad eliminare le cellule in cui il virus è stato risvegliato dalla latenza. Ma quel che Siliciano ha scoperto è che queste non muoiono, dopo la riattivazione, né grazie agli effetti citopatici del virus, né grazie alla reazione dei CD8 dei pazienti in terapia antiretrovirale.

Per addolcire un poco l’amara medicina che ha fatto ingurgitare a tutti fra l’anno scorso e l’altro giorno, quest’anno Siliciano porta al CROI una continuazione della ricerca che l’aveva portato a dimostrare che risvegliare il virus dalla latenza non è sufficiente a far morire le cellule del reservoir.
L’ipotesi avanzata l’altr’anno era che fosse necessario stimolare in qualche modo i CD8, perché facessero meglio il loro lavoro di distruttori delle cellule latentemente infette riattivate. E così, adesso, porta al CROI la ricerca il cui abstract è tradotto qui sotto.

Pre-stimulated Cytotoxic T Lymphocytes from HIV-1+ Patients Eliminate Autologous CD4+ T Cells Infected with HIV-1 from Viral Latent Reservoir - #302

Kai Deng*, L Shan, C Durand, J Blankson, and R Siliciano
Johns Hopkins Univ, Baltimore, MD, US

Background: La HAART può ridurre la viremia nel plasma delle persone con HIV-1 a livelli al di sotto dei limiti dei test clinici, ma non riesce ad eliminare il virus a causa della persistenza virale nei reservoir latenti, principalmente nei CD4 memoria. Le strategie di eradicazione si sono concentrate sulla riattivazione dell’HIV-1 latente in questo reservoir, evitando una riattivazione complessiva dei linfociti T. Il nostro studio fatto recentemente su un modello cellulare primario di latenza dell’HIV-1 ha indicato che la sola riattivazione dell’HIV-1 latente potrebbe non essere sufficiente e che stimolare una reazione dei linfociti T citotossici HIV-1-specifici (CTL) prima della riattivazione del virus potrebbe facilitare la distruzione dei CD4 latentemente infetti generati in vitro. Pertanto, un vaccino basato sui CTL combinato con la riattivazione del virus può essere essenziale per il successo dell’eradicazione virale. Dal momento che lo studio di cui si è parlato prima è stato condotto usando un ceppo di laboratorio di virus reporter, una questione aperta importante è se i CTL di un dato paziente siano in grado di riconoscere e uccidere cellule-target autologhe infettate con virus derivati dal reservoir latente dello stesso paziente.

Metodi: I virus sono stati recuperati dai CD4 memoria quiescenti di pazienti con HIV-1 in HAART soppressiva e sono stati utilizzati per infettare i CD4 estratti dai medesimi pazienti. I CD8 autologhi stimolati in vitro con peptidi virali sono stati messi in coltura con CD4 infetti. L’uccisione delle cellule infette è stata determinata misurando la frazione di CD4 gag+ residui.

Risultati: Dopo pre-stimolazione con peptidi gag del gruppo M consensus, i CD8 dei pazienti in HAART sono stati capaci di riconoscere e uccidere i CD4 autologhi infettati con virus isolati dal reservoir latente dello stesso paziente, mentre i CD8 non stimolati non hanno avuto effetti significativi sulle cellule infette. L’effetto distruttivo ha potuto essere migliorata dall’aumento dei rapporti E:T [efficacia/tossicità] sia per i CTL stimolati, sia per quelli non stimolati. Quando le co-colture sono state messe in un sistema transwell, non si è visto alcun effetto di distruzione.

Conclusioni: I CD8 derivati da un paziente e stimolati con peptiti della gag dell’HIV-1 hanno ucciso in modo efficiente i CD4 autologhi infetti con virus derivati dal reservoir latente dello stesso paziente, confermando che i virus del reservoir latente possono essere riconosciuti da una risposta immune rinforzata. Il nostro studio indica con forza che una vaccinazione che stimoli risposte CTL HIV-1 specifiche prima della riattivazione del virus può contribuire all’eradicazione virale.