[STUDI]Cannon_trapianto staminali umane rese CCR5- in topi 2

[Dora]

Ciao Dora! Anche io ti faccio una domandona da 1 milione di dollari: ma se un paziente ha un virus CXCR4-tropico e non unicamente CCR5, come la mettiamo?

Ciao Cesar, bello che ogni tanto ti riaffacci qui!
Avere un virus X4 o dual-tropico sembrerebbe un gran pasticcio. Ma ricordi? Anche Timothy aveva un virus X4. Eppure ...

Anzi, la fine fatta da quel virus dentro di lui è forse l'aspetto più appassionante di tutta la vicenda, perché ci si aspettava che riemergesse come ceppo dominante. E invece no, è sparito insieme al virus che usava il CCR5. La spiegazione che si diedero i ricercatori che seguono Timothy fu che si era visto in vitro che quella popolazione minoritaria (meno del 3%) di virus X4 presente prima del trapianto dipendeva comunque dal CCR5 per potersi replicare e che quindi, mancando quel co-recettore su tutte le cellule nate dopo il trapianto, anche il virus X4 non aveva potuto far altro che estinguersi.
Certo, è solo un'ipotesi. Ma credo sia anche la ragione per cui non ci si farà fermare dalla presenza di questo tipo di virus quando si tenterà davvero di replicare il successo di Timothy Brown.
Chi come la Cannon non potrà contare sull'effetto "ripulitore" della Graft avrà però un problema in più.
Invece, nell'approccio seguito da Calimmune la presenza di un eventuale virus X4 è meno preoccupante, perché il loro vettore lentivirale LVsh5/C46 - che insieme sottoregola il CCR5 e inibisce la fusione dell'HIV nella cellula - dovrebbe funzionare anche contro i virus che usano il CXCR4 (*) (cfr. il recente articolo di Hütter + Calimmune: CCR5 as a Natural and Modulated Target for Inhibition of HIV. Da notare, però, che fra i criteri di esclusione dall'arruolamento nel trial è esplicitamente elencata anche la presenza di virus X4 - immagino per evitare di avere più problemi del necessario).


[Reminder: approfondire la questione dei virus X4-tropici e della necessità del CCR5 per la loro replicazione. ]


(*) Credo che questo avvenga perché l'approccio di Calimmune è duplice e colpisce due fasi diverse dell'ingresso dell'HIV nella cellula: oltre a bloccare il CCR5, si interviene appunto anche nella fase finale del processo di ingresso dell'HIV, la fusione dell’evelope del virus con la membrana cellulare (quella farmacologicamente inibita dall'enfuvirtide - Fuzeon).

[cesar78]

Grazie Dora, sì ogni tanto (quando posso) mi fa sempre piacere ritornare qui. Il problema è che ci sono tanti nuovi studi e tanti piccoli passi da discutere che vorrei poter avere tempo libero per dedicarmi solo a questo.
Ritornando alla Cannon, e più in generale al discorso eradicazione, mi pare che il distinguo CCR5 - X4 sia un aspetto importante e (forse) una delle chiavi per capire come HIV tenti di sopravvivere nonostante tutti questi bombardamenti al midollo.

Ciao a presto!

[Dora]

Ritornando alla Cannon, e più in generale al discorso eradicazione, mi pare che il distinguo CCR5 - X4 sia un aspetto importante e (forse) una delle chiavi per capire come HIV tenti di sopravvivere nonostante tutti questi bombardamenti al midollo.

Non so, Cesar. Forse è meno importante di quanto credi, anche perché i "bombardamenti al midollo" sono indiscriminati e distruggono cellule che ospitano virus indipendentemente dal tropismo del virus. Il problema, semmai, è che non arrivano ovunque.
In ogni caso, proverò a studiarmi meglio la questione del tropismo, perché l'idea che il virus X4 abbia comunque bisogno del CCR5 per replicarsi mi ha incuriosito.

[Dora]

Avere un virus X4 o dual-tropico sembrerebbe un gran pasticcio. Ma ricordi? Anche Timothy aveva un virus X4. Eppure ...

Anzi, la fine fatta da quel virus dentro di lui è forse l'aspetto più appassionante di tutta la vicenda, perché ci si aspettava che riemergesse come ceppo dominante. E invece no, è sparito insieme al virus che usava il CCR5. La spiegazione che si diedero i ricercatori che seguono Timothy fu che si era visto in vitro che quella popolazione minoritaria (meno del 3%) di virus X4 presente prima del trapianto dipendeva comunque dal CCR5 per potersi replicare e che quindi, mancando quel co-recettore su tutte le cellule nate dopo il trapianto, anche il virus X4 non aveva potuto far altro che estinguersi.

Brevissimo approfondimento sulla questione del virus X4-tropico.
Sto leggendo una bella review dedicata ai Biological and Molecular Aspects of HIV-1 Coreceptor Usage e vi si spiega che le varianti di virus X4 infettano prevalentemente cellule CXCR4+, che in genere hanno il fenotipo di cellula naive oppure di cellula memoria quiescente (cioè non attivata), e che possono pertanto non avere i requisiti intracellulari necessari al virus per dare inizio a un'infezione produttiva. In sostanza, il virus riesce ad entrare perché trova la "porta molecolare" giusta, però poi l'infezione abortisce perché viene bloccata dal tipo di citochine prevalenti all'interno della cellula.
E in effetti, già sapevo che le cellule CCR5+ tendono ad essere attivate, quindi più suscettibili all'infezione, e questo dà ai virus R5-tropici un vantaggio replicativo sui virus X4.

A me pare che anche la "predilezione" del virus X4 per cellule non attivate possa essere una spiegazione del perché quel poco virus X4 presente in Timothy prima del trapianto non è riuscito a reinnescare un'infezione.
Anche in una persona che ospitasse virus X4 e ricevesse un trapianto autologo con staminali rese CCR5- potrebbe dunque non esserci la situazione adatta a questo virus per dare vita a una nuova infezione.
Però è solo una mia deduzione.

[skydrake]

Raffinatissima deduzione.

Sul fatto che a sei mesi dal secondo trapianto avessero trovato in Timothy tracce di virus (non ricordo se del DNA virale o RNA virale), poi scomparse col passare del tempo, non mi aveva convinto la spiegazione avanzata da alcuni ricercatori che "occorreva una quantità minima di virus per sostenere un'infezione".
Ne avevamo parlato un paio di anni fa.
Quindi con il trapianto, i virus di Timothy Brown si sono trovati:
1) un nuovo sistema immunitario con una, seppur debole, graft-versus-host principalmente diretta verso le vecchie cellule del vecchio sistema immunitario che, guarda caso, includono le vecchie cellule provirali
2) una porta chiusa (la CCR5)
3) una porta semichiusa (la CXR4) ma che conduceva perlopiu verso un vicolo cieco.

[Dora]

Continuo qui perché qui abbiamo iniziato a parlarne e perché è una questione importante anche per i trapianti autologhi con staminali rese CCR5 negative, ma segnalerò questo post anche nel thread dedicato a Timothy Brown.


Non so se sia stata una felice intuizione o se Cesar lo sapesse, ma ieri, fra gli "advance access" di Clinical Infectious Diseases, è stato pubblicato un articolo, ancora provvisorio, dedicato proprio alla spiegazione del mancato rebound del virus X4 presente in Timothy prima del trapianto.
Hütter, Deeks e alcuni studiosi belgi e olandesi che non conosco, ma che nel 2011 hanno scritto un lavoro in cui dimostravano che il maraviroc può inibire virus dual-tropici, spiegano qui nei dettagli l'ipotesi avanzata un paio d'anni fa - che sia stata la dipendenza del virus X4 dal recettore CCR5 per potersi replicare ad avere impedito il reinnescarsi dell'infezione dopo il trapianto.
Nelle mie parole, ecco che cosa ci raccontano i medici di Timothy.


Dependence on the CCR5 co-receptor for viral replication explains the lack of rebound of CXCR4-predicted HIV-variants in the Berlin Patient

La glicoproteina gp120 della envelope dell’HIV deve legarsi a un corecettore – che sia il CCR5 o il CXCR4 – perché il virus possa entrare in un CD4 e il tropismo del virus – cioè quale corecettore il virus predilige per penetrare nelle cellule – è determinato soprattutto dalla terza regione ipervariabile della envelope virale (gp120-v3).

Durante un’interruzione della terapia prima del trapianto, il Berlin Patient ha raggiunto una viremia nel plasma di 6,9 milioni di copie/mL e sulla base di un test genotipico standard del tropismo si è visto che quel virus era CCR5-tropico. Ma una analisi dettagliata con un test ultrasensibile ha rilevato una popolazione minoritaria di virus CXCR4-tropico stimata del 2,9% (range 2,7 – 9,3%).

L’aspetto importante da notare in questo tipo di test è che fanno predizioni sul tropismo, non danno risultati assoluti.
I test genotipici, infatti, predicono il tipo di corecettore usato dal virus sulla base di sequenze della envelope dell'HIV per mezzo di algoritmi di interpretazione, che fanno una predizione verso R5 o verso X4.
Questo significa che è possibile – e il caso di Timothy lo dimostra e più sotto lo vedremo – che il tropismo del corecettore, predetto dai test genotipici standard usati nella pratica clinica per stabilire chi può usare un inibitore del CCR5 come il maraviroc, non rifletta sempre il comportamento reale del virus. Infatti, in questo caso era presente un virus che il test prevedeva fosse X4, ma che di fatto dipendeva dal CCR5 per poter entrare nella cellula (si è già visto che certi virus dual-tropici preferiscono usare come corecettore il CCR5 e infatti vengono definiti R5>X4, o dual-R5-tropici, mentre altri usano più efficientemente il CXCR4 e vengono chiamati X4>R5 o dual-X4).

[divbox]Detto brutalmente: i test ci dicevano che c'era del virus X4, ma si sbagliavano - o noi li interpretavamo male, o comunque quel virus aveva un comportamento un po' strano.[/divbox]

Due mesi dopo il trapianto, si è potuta osservare la ricostituzione del comparto dei CD4, che presentavano il fenotipo del donatore, cioè la doppia delezione Δ32 sul gene CCR5.
Queste cellule derivate dal donatore presentavano sulla superficie livelli normali del corecettore CXCR4.
Dal momento che era stato rilevato del virus X4 prima del trapianto, ci si poteva aspettare che questo tipo di virus ricomparisse dopo il trapianto e la sospensione della ART. Invece non si è verificato nessun rebound e il paziente è ancora libero dal virus a tanti anni di distanza.

I collaboratori belgi e olandesi di Hütter e Deeks hanno dimostrato in passato che alcuni virus capaci di usare il CXCR4 hanno in vivo una chiara preferenza per il corecettore CCR5.
Sulla base di questi risultati, è stata formulata l’ipotesi che un rebound di virus X4 non si sia verificato nel Berlin Patient a causa della dipendenza di questo virus dal corecettore CCR5 per la propria replicazione.

Dopo avere clonato il virus ritenuto X4-tropico presente in Timothy prima del trapianto e averne confermato il tropismo con metodi diversi, ne è stata indagata la capacità replicativa e la si è confrontata con le varianti R5-tropiche maggioritarie prima del trapianto.
Si è visto che i ceppi dominanti CCR5 e degli altri virus R5 di controllo erano capaci di infettare le cellule che esprimevano il CCR5, ma non quelle che esprimevano il CXCR4. Invece, il virus X4-tropico era capace di infettare soltanto le cellule che esprimevano un fenotipo completo CXCR4.
Questo era abbastanza scontato. Ma l’aspetto interessante di questi esperimenti è che hanno mostrato come tutte le varianti X4 siano state capaci di replicarsi solo in cellule che esprimevano anche il CCR5 – in questo modo si è dimostrata la dipendenza del virus X4 dalla presenza del corecettore CCR5.
E questa dipendenza è stata dimostrata sia in linee cellulari clonate in laboratorio, sia in CD4 “naturali”, che esprimevano entrambi i corecettori.
Sono poi stati usati il maraviroc che, in quanto antagonista del CCR5, permetteva di simulare il fenotipo CCR5Δ32/Δ32, e l’AMD-3100, che è una sostanza che blocca il CXCR4. Come ci si aspettava, le varianti R5 sono state completamente inibite dal maraviroc, ma non dall’AMD-3100. Invece, le varianti X4 non sono state inibite dall’AMD-3100, ma hanno dimostrato una dipendenza dal CCR5 nei CD4 “naturali”.
L’ultimo passo è stato l’andare a vedere se un virus X4-tropico era capace di infettare le nuove cellule di Timothy CCR5Δ32/Δ32. Questi esperimenti hanno dimostrato che mentre queste cellule possono essere infettate da un virus X4 preso come riferimento, non possono esserlo dal virus che era presente in Timothy prima del trapianto.

Nel Berlin Patient, cellule che presentavano sulla superficie il CCR5 sono state rilevabili nel colon per almeno 5,5 mesi dopo il trapianto e si è rilevato del DNA provirale 2 mesi dopo il trapianto. Più di 5 anni dopo, usando dei test ultra-sensibili, si sono rilevati intermittenti, bassissimi livelli di DNA e di RNA virale. Dal momento che la combinazione fra cellule che esprimono il CCR5 e hanno una vita molto lunga e potenziale reservoir di HIV CCR5-tropico è – come viene definita nell’articolo – “volatile”, la replicazione dell’HIV avrebbe anche potuto continuare.
In quel caso, la replicazione di virus R5 residui in una situazione in cui c’era un crescente numero di cellule che erano CCR5 negative ma CXCR4 positive, avrebbe potuto portare il virus ad utilizzare il CXCR4.
Hütter, Deeks e colleghi hanno dunque testato la possibile evoluzione verso l’uso del corecettore CXCR4 di virus prelevati da pazienti in cui i test genotipici avevano predetto la presenza di virus X4. Questa evoluzione del virus verso l’uso del CXCR4 non l’hanno osservata e ne hanno quindi dedotto che la barriera genetica al cambiamento del tropismo deve essere relativamente alta.
Quando si era constatato che in Timothy non si aveva rebound virale era stata avanzata l’ipotesi che i CD4 che dopo il trapianto continuavano ad esprimere il CCR5 fossero troppo pochi per supportare la replicazione di varianti di virus R5 e quindi per permettere un’evoluzione del virus verso l’uso del CXCR4.
Nel caso del Berlin Patient, a parte l’assenza di virus X4-tropico, il fatto che non si sia verificato un rebound di virus R5-tropico immediatamente dopo il trapianto quando la ART è stata sospesa indica che l’elemento cruciale della cura è stato il fatto che le staminali erano CCR5Δ32/Δ32.

Questo risultato fornisce dunque un razionale alle terapie geniche basate sul trapianto di staminali rese CCR5 negative (e ci dice anche che servono analisi molto approfondite sul tropismo del virus prima di fare qualsiasi esperimento di trapianto).

[cesar78]

No, non sapevo dell'articolo, anche se su questa domanda giravano voci da tempo... La mia personalissima conclusione è che il Paziente di Berlino aveva (ha) virus X4 incapace di replicazione, e che i test fatti prima del trapianto fossero nella direzione giusta. Che poi il virus non abbia fatto quello che ci si aspettava (legarsi tramite CXCR4) è perchè HIV è scemo.
Conclusione: virus X4 incapace, in unità bassissime e non infettivo -> guarito!

Il problema è replicare questa soluzione. Non credo però che sia bene concentrarsi totalmente ed esclusivamente sui CCR5: i collaboratori belgi e olandesi non ci dicono in che percentuali i virus X4 usano corecettori CCR5. Penso pochissimi. La Cannon ha preso in considerazione le percentuali generali dei due tropismi?

[Dora]

Non credo però che sia bene concentrarsi totalmente ed esclusivamente sui CCR5: i collaboratori belgi e olandesi non ci dicono in che percentuali i virus X4 usano corecettori CCR5. Penso pochissimi.

Penso anch'io. Credo sia stata una fortunata casualità sulla quale non si può ovviamente fare alcun conto in casi futuri (anche se forse la preferenza dei virus X4 per cellule non attivate può giocare in favore della sua scomparsa).

La Cannon ha preso in considerazione le percentuali generali dei due tropismi?

I suoi topi - quelli dell'articolo su Nature Biotechnology del 2010 - dopo avere ricevuto staminali umane CCR5 negative, sono stati infettati con HIV-1BAL, che è un ceppo molto aggressivo di virus CCR5-tropico.
Io credo che chiunque pensi di sperimentare la delezione del CCR5 da staminali o anche CD4 per via di terapia genica si guarderà bene dall'arruolare nei trial persone che abbiano virus X4-tropico (l'ha evitato perfino Calimmune, il cui approccio dovrebbe proteggere le cellule da tutti i ceppi di HIV, indipendentemente dal tropismo e quando nei vari trial Sangamo è emerso in qualche paziente un virus X4 è stato un disastro).
Non mi pare che ci si possa permettere un simile fattore di disturbo in sperimentazioni tanto delicate.

[Dora]

Questa è una notizia che mi rende davvero felice (anche pensando a quanto avrebbe fatto piacere a Leon, che insieme a me ha atteso dal 2010 che potesse partire il trial sul lavoro di Paula Cannon): il CIRM (California Institute for Regenerative Medicine), che ha già finanziato con 34 milioni di dollari questa ricerca, si propone di stanziare - ed è notizia freschissima, che arriva da un report per una riunione del CIRM che si terrà fra due giorni - altri 5,5 milioni.

La cosa davvero interessante, però, non è solo la notizia dell'erogazione di un nuovo finanziamento, ma anche il fatto che si comincia a capire come sarà impostata la sperimentazione clinica: SARÀ SU PERSONE CON HIV IN ART E CON NUMERO DI CD4 SUB-OTTIMALE, cioè immunologic non responders. E quel che più mi colpisce è che NON SI PARLI DI UNA CONCOMITANTE NEOPLASIA EMATOLOGICA. NIENTE LINFOMI, NIENTE LEUCEMIE, SOLO PERSONE CON HIV E BASSI CD4 (cfr. p.22: "SP3A-07536: A Phase I, Open-Label Study to Assess the Safety, Feasibility and Engraftment of Zinc Finger Nucleases (ZFN) CCR5 Modified Autologous CD34+ Hematopoietic Stem/Progenitor Cells with Escalating Doses of Bulsulfan in HIV-1 (R5) Infected Subjects with Suboptimal CD4 Levels on cART").

A me pare che questo - se sarà confermato - sia un aspetto straordinario, che era forse stato vagamente annunciato dalla Cannon nei mesi scorsi, e che renderebbe questa sperimentazione molto diversa da quelle (poche) analoghe che l'hanno preceduta. Un aspetto che segna un passaggio di fase nei trapianti di staminali, che fino ad oggi, nelle persone con HIV, sono stati tentati solo se c'era anche, a giustificarne i rischi, una gravissima patologia ematologica che non rispondeva alle chemioterapie.
Non so se dipenda dalla sicurezza che Cannon e colleghi hanno sulla non tossicità delle loro staminali modificate ma, se davvero opereranno i trapianti su persone che hanno solo l'HIV, si troveranno con pazienti in condizioni infinitamente migliori rispetto a quelli che hanno affrontato i trapianti di staminali fino ad oggi, con ciò aumentando enormemente le probabilità di successo (e il numero di pazienti che possono beneficiare del trattamento).

[stealthy]

Leon <3