Keanu ha scritto:vorrei farti una domanda Dora sugli errori di CRISPR/Cas9 nel taglio del DNA provirale, a cui sicuramente saprai rispondere: non ho capito se l'enzima non è poi così tanto preciso come si prospettava (nel senso che non è sempre in grado di individuare il virus integrato) o se, pur tagliando, diciamo, il 60% del DNA provirale(
) il restante 40% ricombinandosi con il DNA della cellula può essere resistente all'enzima stesso e quindi più aggressivo (questa mi sembra un'ipotesi assurda, se privassero una cellula di una gran parte del suo DNA non credo che la cellula riesca quanto meno a dividersi in cellule figlie sane. Come fa un microorganismo, per di più latente e quiescente se parliamo di cellule latentemente infette, privato di gran parte del suo dna, a evolversi verso il meglio e a sopraffare l'enzima?
).
Non ti so rispondere
sicuramente, anzi dubito di essere in grado di risponderti. Ci provo con la speranza di non dire troppe bestialità.
Anzitutto, io ti suggerirei di abbandonare la metafora della sopraffazione fra virus ed enzima, perché mi pare ti stia mettendo fuori strada: non è una guerra in cui l'entità "virus" e l'entità "enzima" *combattono* e se l'enzima sbaglia allora il virus ha la meglio sull'enzima - se l'enzima arriva a destinazione, cioè dentro la cellula latentemente infetta, distrugge le molecole che è stato costruito per distruggere. Queste molecole sono solo e soltanto quelle che costituiscono parti di un gene, che nel caso in questione è uno dei geni di HIV che gli servono per replicarsi.
Se si verifica l'incontro chimico fra enzima e gene, il gene viene alterato in modo da non essere più funzionante. A quel punto, se il danno è sufficientemente grave (e dovrebbe esserlo perché le CRISPR/Cas9 sono costruite per distruggere geni di cui HIV non può fare a meno), il virus che usa quel gene per riprodursi non riesce più a farlo.
Parallelamente, i meccanismi di autoriparazione del DNA ricongiungono le parti tagliate, in un certo senso come se suturassero una ferita, così che il genoma risulti intatto e la cellula - "risanata" - possa continuare a funzionare.
Se l'enzima "sbaglia" a riconoscere il bersaglio e colpisce un gene che o per posizione è molto vicino, o per conformazione è molto simile, al suo bersaglio originario, si ha l'effetto off target (che con le CRISPR pare sia minimo).
Se l'enzima - per ragioni che credo abbiano a che fare con la situazione biochimica dell'ambiente in cui deve operare - non arriva correttamente a destinazione (e questo purtroppo accade di frequente), cioè se l'RNA guida non riesce a portarlo dentro la cellula, allora non succede niente: l'enzima si dissolve e il gene del virus se ne resta dov'è, pronto a contribuire alla trascrizione e formazione di nuovi virioni nel caso qualche evento molecolare inducesse il virus a ricominciare a replicarsi.
La percentuale dei successi delle CRISPR/Cas9, dunque, non devi valutarla come "abbiamo un 60% di DNA provirale distrutto all'interno di una singola cellula, quindi che cosa succede con quell'altro 40%", ma come "le CRISPR/Cas9 arrivano al 60% (magari!) delle cellule latentemente infette, o al 40% o a quel che è".
Il problema che forse ha sollecitato la tua domanda, quello evidenziato dal
lavoro di Liang e colleghi di cui abbiamo parlato qualche settimana fa - di alterazioni del virus che, invece di renderlo meno capace di riprodursi, l'hanno reso più aggressivo - non deriva da "errori" delle CRISPR, ma da errori del meccanismo di riparazione del DNA: la Cas9 ha tagliato il gene che doveva tagliare, ma poi la "sutura" che ha rimesso insieme le basi di DNA non è risultata tale da disattivare l'HIV, ma anzi l'ha reso più forte.
È chiaro che se non si fossero mandate le CRISPR/Cas9 dentro la cellula questo non sarebbe successo e che quindi se si vorrà usare questo strumento
in vivo bisognerà trovare il modo di evitare il danno. Ma il problema è dalla parte del DNA, non degli enzimi.
