[STUDI] Sangamo: CD4 e staminali resi CCR5- mediante ZFN II

[Dora]

Riporto l'abstract di June dal comunicato stampa di Sangamo, perché al momento sul sito del CROI non c'è.

Thursday, March 8, 2012

Abstract # 155 "Induction of Acquired CCR5 Deficiency with Zinc Finger Nuclease (ZFN) Modified Autologous CD4 T-cells (SB-728-T) Correlates with Increases in CD4 Count and Effects on Viral Load (VL) in HIV-infected Subjects"

21 HIV-infected subjects were enrolled in Phase 1 clinical studies at the University of Pennsylvania and in California (SB-728-902) and received a single dose of SB-728-T (5 to 30 billion cells). All subjects were taking highly active antiretroviral therapy (HAART) and had stably controlled undetectable levels of HIV in their blood. Subjects were classified into two groups based on their CD4+ T-cell counts: one group of 15 subjects, with CD4+ T-cell counts below 500 cells/ ul designated Immune Non-Responders (INR), and a second group of six subjects with CD4+ T-cell counts of greater than 450 cells/ ul designated Immune Responders (IR). One month after SB-728-T treatment, six subjects in the INR group enrolled in the University of Pennsylvania study underwent a 12-week treatment interruption (TI) of their HAART.

The studies evaluated safety and tolerability, changes in CD4+ T-cell counts and the ratio of CD4+ to CD8+ T-cells as well as persistence of SB-728-T in the blood and trafficking of these ZFN-modified cells into gut-associated lymph tissue. In addition, viral DNA and changes in viral load (VL), as measured by HIV-RNA, were measured during the TI in the six INR subjects.

These studies demonstrated:

• - During the TI, the viral load, as measured by HIV-RNA levels, initially increased as expected in all six subjects. Subsequently, a 0.8 to > 2.0-log reduction in VL from peak achieved during the TI was observed in 3 of 6 subjects with the highest estimated circulating levels of cells with biallelic modification of their CCR5 gene. In one subject (Subject 205) VL decreased to undetectable levels such that the subject was aviremic at the end of the TI period. This subject entered the study carrying the natural CCR5 delta-32 mutation on one copy of his CCR5 gene resulting in an estimated percentage of biallelically-disrupted CCR5 genes that was twice that of subjects entering the study with wild-type CCR5 genes.
  
  - Control of HIV-RNA (suppression of VL) correlates significantly (p < 0.05) with calculated levels of circulating CD4+ T-cells that have undergone biallelic modification (i.e. modification of both copies) of the CCR5 gene.
  
  - The level of circulating viral DNA, a measure of the viral reservoir, exhibited a limited increase in five of six subjects over this period and was elevated in only one subject whose SB-728-T engraftment was the lowest of the group.
  
  - Confirmation and extension of previous observations of unprecedented improvements in overall CD4+ T-cell counts and CD4+ to CD8+ T-cell ratios, a measure of immune health, for over a year post administration of SB-728-T.
  
  - Elevated levels of certain T-cell cytokines (IL-2, IL-7 and IL-15) in the blood in the first few days post SB-728-T infusion which may have a role in the dramatic post-infusion expansion of CD4+T-cells. The magnitude of this increase was marked in Subject 205, who had an undetectable VL at the end of the TI.
  Durable engraftment and persistence of ZFN-CCR5-modified cells (SB-728-T) in the peripheral blood for over a year (range: 90-738 days).
  
  - Ability of SB-728-T to traffic to the gut mucosa, an important reservoir of active HIV infection.
  
  - SB-728-T treatment continues to be safe and well tolerated with only mild, reversible symptoms typical of infusion reactions.

[carletto]

un aggiornamento che mi ha passato Meli http://www.aidsmeds.com/articles/hiv_sa ... 2063.shtml

non sembra male... questa sembra una cura funzionale ...madonna mi basterebbe anche solamente questa..... intanto che aspettiamo Margolis e Siliciano

[Dora]

un aggiornamento che mi ha passato Meli http://www.aidsmeds.com/articles/hiv_sa ... 2063.shtml

Ringrazia Melisanda, ma dille per favore, da parte mia, che una settimana di latitanza basta e AVANZA. Che si spicci a tornare!!

non sembra male... questa sembra una cura funzionale ...madonna mi basterebbe anche solamente questa..... intanto che aspettiamo Margolis e Siliciano

No, anche a me non sembra male, però non vedo particolari progressi rispetto a quanto già sapevamo dopo l’ICAAC dello scorso settembre. Insomma, mi aspettavo qualcosina di più.

Comunque sia, dato che degli abstract - per quanto quelli di Sangamo di solito siano fatti bene - è sempre meglio non fidarsi, ho finito proprio adesso di ascoltarmi la lezione di Pablo Tebas (lo ammetto, quando ho visto il programma, ho IMPLORATO gli organizzatori del CROI di sostituirlo con Lalezari. Ma loro si sono RIFIUTATI, sostenendo che la ricerca è importante e bisogna seguirla senza farsi distrarre da considerazioni estrinseche e mi hanno MINACCIATO, qualora avessi insisitito, di chiamare Mitsuyasu …).

Allora, Tebas ha parlato di Induction of Acquired CCR5 Deficiency with Zinc Finger Nuclease-modified Autologous CD4 T Cells (SB-728-T) Correlates with Increases in CD4 Count and Effects on Viral Load in HIV+Subjects, mettendo insieme i due studi - quello della Pennsylvania University di June e quello di Jay e della UCSF – e quindi considerando insieme il gruppo dei pazienti con alti CD4 che hanno fatto una sospensione della terapia con quello degli immunologic non responders.

Molto in breve, poi seguiranno le slides della lezione (e nel messaggio a seguire il poster di Lalezari, perché riporta i dati specifici relativi al suo trial).

• • La modificazione dei CD4 con l’SB-728-T continua a mostrarsi sicura e ben tollerata, gli eventi avversi di una certa entità sono stati rari e tutti reversibili.
  • Si è visto un aumento dei CD4 in entrambi i gruppi, maggiore nei pazienti che partivano da un alto numero di CD4, minore negli altri, ma comunque sia consistente, sia persistente dopo un anno di follow-up. Analogo discorso sui CD4 modificati, che sono stati rilevati – in un caso - fino a 2 anni dopo il trattamento. Inoltre, le cellule sono andate a ripopolare la mucosa gastrointestinale.
  • Il rapporto CD4:CD8 si è normalizzato negli immunologic non responders, mentre negli altri è aumentato.
  • Si sono rilevati alti livelli di IL-2, IL-7 e IL-15 subito dopo l’infusione dei CD4, che potrebbero spiegare la rapidità dell’espansione dei CD4 trasfusi.
  • Dopo la sospensione della HAART, si è avuto un iniziale rialzo delle viremie, seguito da un crollo (da 0,8 a 2 log) in 3 dei 6 pazienti. Al paziente che già di suo era omozigote Delta32, la viremia è rimasta irrilevabile fino a quando – in base al protocollo – ha comunque dovuto riprendere la HAART.
  • Prendendo come misura del reservoir i livelli di DNA provirale nei CD4, in 2 pazienti su 6, all’interruzione della terapia, si sono visti aumenti di 4 e di 9 volte. Tuttavia, questi aumenti si sono invertiti alla ripresa della HAART.

Molto interessanti, qualcuna insidiosa, le domande fatte alla fine della presentazione Tebas.

Domanda di Lafeuillade: avevete dei dati sull’infiammazione persistente durante questo tipo di terapia? Se davvero si vuole parlare di “cura funzionale”, questa non può essere limitata alla viremia e agli aspetti virologici, ma deve estendersi anche allo stato infiammatorio: avete dei dati riguardo al fatto che questa terapia è in grado di migliorare l’infiammazione cronica? Oppure chi riesce a mantenere un controllo della viremia continua ad avere a che fare con l’infiammazione?

Risposta di Tebas: anzitutto, non abbiamo ancora curato nessuno. In secondo luogo, non abbiamo raccolto marker specifici dell’infiammazione. Ma è ovvio che qualsiasi strategia di cura deve coinvolgere la questione dell’infiammazione.

Jonh Coffin: nei pazienti Delta32 ci si può attendere una selezione maggiore delle cellule contenenti la delezione del CCR5. È così?

Risposta di Tebas: la raccolta dei dati è ancora in corso. Fino ad ora non abbiamo notato una selezione durante l’interruzione di trattamento nella coorte della Pennsylvania University. Nella coorte californiana, in chi ha interrotto il trattamento, si è visto all’inizio un aumento della selezione delle cellule geneticamente modificate. Ma la dimensione del campione è ancora troppo piccola per trarne delle valutazioni.

Domanda di un ragazzo che non ho capito come si chiami: avete idea di che cosa accada del reservoir nei macrofagi?

Risposta di Tebas: no, ma il reservoir importante è quello dei CD4 memoria.

Altra domanda: che è accaduto del tropismo del virus nei pazienti viremici?

Tebas: non abbiamo notato cambiamenti nel tropismo. Se ci fosse davvero una pressione genetica, ne saremmo felici, perché significherebbe che la terapia funziona davvero.

John Mellors: puoi parlarci dell’espansione ex vivo e della reinfusione, in particolare hai idea di quante cellule infette da HIV sono state reinfuse? Si è creata un’espansione selettiva di cellule contenenti provirus e quindi un’espansione del reservoir?

Tebas: è possibile che venga espanso il DNA provirale. Non abbiamo valutato con attenzione la dimensione del reservoir che abbiamo reinfuso nei pazienti. È però anche possibile che sia stato distrutto. Dovremo fare analisi più approfondite.

[Dora]

Ed ora eccolo qui, nel pieno del suo splendore, il poster di Lalezari fatto a pezzi:

Paper #433 - A Single Infusion of Zinc Finger Nuclease CCR5 Modified Autologous CD4 T Cells (SB-728-T) Increases CD4 Counts and Leads to Decrease in HIV Proviral Load in an Aviremic HIV-infected Subject

Jay Lalezari*1, R Mitsuyasu2, S Wang3, G Lee3, M Giedlin3, W Tang3, K Spratt3, R Surosky3, N Dubois-Stringfellow3, and D Ando3

1Quest Clin Res, San Francisco, CA, US; 2Univ of California, Los Angeles, US; and 3Sangamo BioSci, Richmond, CA, US


Riposto anche l’abstract, ché così è più carino, e tutte le slides tranne quelle che sappiamo tutti a memoria sul razionale della sperimentazione.

[Dora]

Carl June, insieme a tanti colleghi della Pennsylvania University più altri della UCLA (sia San Francisco, sia Los Angeles) e naturalmente Sangamo, ha pubblicato ieri su Science Translational Medicine (cui mi spiace, ma non ho accesso) un articolo che - stando all'abstract e alle recensioni che ho letto - dovrebbe infondere una certa fiducia in chi teme gli effetti mutageni a lungo termine della modificazione genetica dei linfociti T (in particolare, il timore è che vengano inseriti oncogeni, capaci di causare leucemie): Decade-Long Safety and Function of Retroviral-Modified Chimeric Antigen Receptor T Cells.

Infatti, un follow-up di più di 10 anni ha dimostrato che la modificazione genetica dei T mediante vettori retrovirali è sicura e persistente.

Riassumo da due articoli usciti su Medscape (Gene Transfer Stable and Persistent in HIV-Infected Patients) e su Bloomberg (Gene Therapy Safe in Decade-Long HIV Study That May Widen Use), che mi sembrano i più completi fra quelli che ho visto.

• • Sono stati studiati 43 pazienti HIV positivi, arruolati in tre diversi trial clinici dal 1998 al 2002. Un vettore retrovirale aveva introdotto il gene per il recettore di un antigene chimera (CAR) entro i CD4 e i CD8 dei pazienti, in modo da rendere questi linfociti T capaci di riconoscere la glicoproteina dell’envelope gp120 e innescare una risposta immunitaria.
  
  • Ad oggi, tutti i pazienti stanno bene e 41 su 43 presentano ancora cellule modificate perfettamente funzionanti, che dimostrano dunque di avere proliferato, di avere un’emivita di più di 15 anni e di essere presenti in quantità stabili.
  
  • Inoltre, non si sono verificate espansioni clonali di questo sottinsieme dei linfociti T. Questo è importantissimo, perché significa che non si sono formati precursori leucemici.
  
  • Un altro aspetto rilevante è che le cellule modificate sono riuscite a proliferare senza che ci dovesse essere un preesistente stato di immunosoppressione.
  
  • Il limite di questo studio è che l’HIV in questi pazienti non è sceso a livelli irrilevabili senza terapia. L’ipotesi fatta da June e colleghi è che probabilmente la quantità di linfociti T modificati era troppo bassa.

P.S. A quanto pare, le staminali sono molto più delicate dei linfociti maturi. Quindi la preoccupazione per i danni che si possono causare modificandole geneticamente è maggiore per questo tipo di cellule. Di qui le ancor più severe cautele imposte dall'FDA.

[Dora]

È uscita ieri su Nature Methods una “brief communication” di alcuni ricercatori dello Scripps Research Institute: Targeted gene knockout by direct delivery of ZFN proteins.
Purtroppo non ho accesso a questa rivista, quindi posso basarmi soltanto sul comunicato stampa (Scripps Research Institute Scientists Develop Alternative to Gene Therapy) e su un paio di post che ho trovato in giro, che più o meno ripetono le stesse cose (COULD ZNF TRUMP HIV? e Naked ZFNs Point to More Efficient, Safer Gene Therapy).

Si tratta di un lavoro interessante, perché il gruppo di ricerca guidato dal chimico Carlos Barbas ha scoperto un modo che pare incredibilmente semplice e sicuro per distruggere specifici geni all’interno delle cellule. Hanno utilizzato le nucleasi a dita di zinco, come per esempio fa Sangamo per distruggere il CCR5 da CD4 e staminali, MA SENZA BISOGNO DI PORTARE LE ZFN AL BERSAGLIO MEDIANTE UN VETTORE LENTIVIRALE.

Il procedimento è banale, nella sua semplicità: hanno aggiunto questi enzimi direttamente alle cellule messe a coltura e, dopo poche ore, hanno scoperto che le ZFN, da sole, andavano a tagliare via proprio il gene che si voleva distruggessero in un buon numero di cellule.
Il tutto, in modo estremamente efficiente, rapido e senza danni collaterali (off-target piuttosto spiacevoli, quali ad esempio la distruzione del CCR2 al posto del CCR5).

Ma non è finita qui. Questa tecnica può essere utilizzata sia sui CD4, sia sui fibroblasti della pelle, che vengono “ringiovaniti”, facendoli regredire allo stadio di cellule staminali pluripotenti e poi modificati, in modo da distruggere il CCR5 e dare vita a una progenie di linfociti T resistenti a quelle varianti di HIV che usano il CCR5 per entrare nelle cellule.

Perché questo lavoro pare molto, molto carino? Perché, se davvero tutto questo funziona, Barbas e colleghi hanno trovato il modo di evitare di usare i vettori lentivirali, e quindi sia di aggirare i rischi di mutagenesi inserzionale che questi comportano, sia di modificare le cellule più rapidamente e a costi più bassi.

Quindi, trial clinici come quelli in atto sui CD4 o come quello atteso della Cannon sulle staminali potrebbero grandemente beneficiare di questa nuova tecnica di distruzione del CCR5.

[skydrake]

Sei riuscita a trovare qualche anticipazione su quante mutazioni MONOzigote è in grado di indurre questa tecnica? Oppure alla fine ai otterranno un mix di eterozigote e monozigote con ovvie difficoltà a distinguerle?

[Leon]

il gruppo di ricerca guidato dal chimico Carlos Barbas ha scoperto un modo che pare incredibilmente semplice e sicuro per distruggere specifici geni all’interno delle cellule. Hanno utilizzato le nucleasi a dita di zinco, come per esempio fa Sangamo per distruggere il CCR5 da CD4 e staminali, MA SENZA BISOGNO DI PORTARE LE ZFN AL BERSAGLIO MEDIANTE UN VETTORE LENTIVIRALE.

La differenza mi pare abissale. In più, leggendo gli ottimi articoli che hai segnalato, ho appreso che questo Barbas (il tipico "ingegnoso" alla Mullis, che sarà anche un pazzo furioso ma così averne!) è nientepopodimeno che quello che la tecnica delle dita di zinco... l'ha inventata (e quindi si suppone che qualcosina ne sappia)!!!

L'interrogativo è: l'aver trovato il sistema (che di preciso non so né sarei in grado di capire, ma in uno dei già detti articoli si legge, per esempio, di un "trucco" legato alla temperatura a cui vengono mantenute le cellule messe a contatto con le ZFN) di fare a meno tutto l'ambaradan rappresentato dal vettore con dentro il gene che codifica per la ZFN del caso, utilizzando invece la ZFN già bell'e pronta (con tutti i vantaggi che ne derivano in termini di sicurezza e precisione, vuoi riguardanti i rischi di mutagenesi, vuoi quelli di "tagli" nel punto sbagliato), si tradurrà in un'accelerazione della marcia verso la clinica?

Oppure il "panico da staminali" (perché sono queste che ci interessano - dei CD4 maturi "sangamizzati" sappiam ben che farcene!) continuerà ad avere la meglio e questa "ripartenza da zero" finirà invece per provocare un ritardo, bloccando ancor peggio di quanto già è la sperimentazione sull'uomo di metodiche sì più rischiose, ma anche molto più mature (quelle con l'ambaradan di cui sopra)?

[Dora]

ho appreso che questo Barbas (il tipico "ingegnoso" alla Mullis, che sarà anche un pazzo furioso ma così averne!) è nientepopodimeno che quello che la tecnica delle dita di zinco... l'ha inventata (e quindi si suppone che qualcosina ne sappia)!!!

A proposito di Barbas, ricordo che l'estate scorsa - quando Cristof von Kalle e Sangamo fecero uscire uno studio in cui analizzavano gli errori commessi in vivo con le ZFN e le rotture off-target (An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity), Gregory (Sangamo) aveva dichiarato a The Scientist che le ZFN sono estremamente specifiche e che i bassi dosaggi usati nella clinica non dovrebbero causare praticamente mai dei tagli fuori bersaglio. Nella stessa occasione, Barbas fu intervistato come esperto indipendente e spiegò che fino a quel momento mancava un metodo chiaro per definire la specificità delle nucleasi a dita di zinco. Ma che era diventato di vitale importanza capire dove davvero vengano fatte le modifiche al genoma, perché si era ormai passati alla fase clinica.

Ora ho scoperto che ha un laboratorio allo Scripps che porta addirittura il suo nome e ha una ventina di collaboratori. Il sito che descrive le sue attività è davvero molto bello, pieno di animazioni e di articoli e vale proprio la pena di visitarlo:

• THE BARBAS LAB

(Già che ci siete, leggete questo articolo, in cui si spiega in dettaglio quello che Leon ha ricordato - che abbiamo a che fare con uno dei papà delle ZFN: Designer Zinc Finger Proteins.)

L'interrogativo è: l'aver trovato il sistema (che di preciso non so né sarei in grado di capire, ma in uno dei già detti articoli si legge, per esempio, di un "trucco" legato alla temperatura a cui vengono mantenute le cellule messe a contatto con le ZFN) di fare a meno tutto l'ambaradan rappresentato dal vettore con dentro il gene che codifica per la ZFN del caso, utilizzando invece la ZFN già bell'e pronta (con tutti i vantaggi che ne derivano in termini di sicurezza e precisione, vuoi riguardanti i rischi di mutagenesi, vuoi quelli di "tagli" nel punto sbagliato), si tradurrà in un'accelerazione della marcia verso la clinica?

Oppure il "panico da staminali" (perché sono queste che ci interessano - dei CD4 maturi "sangamizzati" sappiam ben che farcene!) continuerà ad avere la meglio e questa "ripartenza da zero" finirà invece per provocare un ritardo, bloccando ancor peggio di quanto già è la sperimentazione sull'uomo di metodiche sì più rischiose, ma anche molto più mature (quelle con l'ambaradan di cui sopra)?

Proviamo a vederla per il bene e speriamo che serva anche a sbloccare la nostra Paula e a dare stimolo a tutto questo filone di ricerca.

C'è poi l'aspetto del "ringiovanimento" dei fibroblasti fino a riportarli allo stato di staminali pluripotenti su cui versare il brodino di ZFN, che è l'altra parte davvero affascinante di questo lavoro. Se ho capito bene, significherebbe, fra l'altro,

• - prelevare dal paziente stesso delle cellule che sono sicuramente non infette,
  - portarle indietro nel tempo,
  - avere delle staminali ematopoietiche "pulite",
  - modificarle in modo rapido, efficiente e meno rischioso che inserendo un lentivirus,
  - fare un trapianto autologo, con meno rischi di un eterologo,
  - creare un nuovo sistema immunitario prevalentemente CCR5 negativo.

P.S. Leon, tu che magari hai accessi privilegiati di cui neppure sospetto l'esistenza, non riusciresti a trovare l'articolo su Nature Methods?

[Leon]

P.S. Leon, tu che magari hai accessi privilegiati di cui neppure sospetto l'esistenza, non riusciresti a trovare l'articolo su Nature Methods?

No, al momento sono messo malissimo dal punto di vista reperimento letteratura. A consolazione, ti dico però che, secondo me, non è necessario straapprofondire qualunque cosa, anche perché, per quanto mi riguarda, sono certo che non avrei assolutamente i mezzi per comprendere, né tanto meno per giudicare, un lavoro di questo tipo.

Quindi direi: quando, su certi studi sicuramente molto tecnici e complessi riguardanti la ricerca di base, si trovano (come hai trovato) dei resoconti esaurienti, ben fatti e che non lasciano particolari dubbi o interrogativi, fermiamoci a questi, almeno in prima battuta!