[STUDI] "Bryologs": briostatina sintetica (Paul Wender)

[Keanu]

Io mi chiedo piuttosto se si vedrà qualche effetto sul reservoir.
E la cosa che mi lascia più perplessa è che gli studi su modelli cellulari di latenza anche molto simili hanno dato risultati estremamente variabili; per non parlare degli studi su cellule primarie, che hanno dato indicazioni del tutto contrastanti (cfr. An In-Depth Comparison of Latent HIV-1 Reactivation in Multiple Cell Model Systems and Resting CD4+ T Cells from Aviremic Patients).
In una situazione di tale ambiguità, io mi sarei aspettata dei lavori robusti su modelli animali, soprattutto sulle scimmie. Ma non mi risulta che ne siano stati fatti in generale, né in particolare da Moreno e Mugñoz, che sono i ricercatori spagnoli che adesso stanno facendo il trial e che da molti anni stavano spingendo per portare la briostatina in fase clinica.
Credo che comunque il loro obiettivo sia arrivare a sperimentare insieme briostatina-1 e un HDACi, perché contano sul potenziamento sinergico dei loro singoli effetti (che loro hanno visto in vitro ormai 5 anni fa). E, dato che in qualche modo dovevano pur partire, hanno scelto un protocollo che più prudente non si può.
Quindi, più che la tossicità, il rischio vero - pare a me - è che possa essere così difficile misurare una qualsiasi anche minima efficacia anti-latenza della briostatina da farla considerare di fatto inutile da usarsi in vivo.

Cioè sono passati direttamente dallo studio in vitro a quello ex vivo su esseri umani senza passare per i modelli animali? Se i risultati in vitro erano già così ambigui, nella sperimentazione ex vivo sarà l'ennesimo fallimento!
Al limite la briostatina potrebbe essere anche usata assieme alle altre sostanze anti-latenza circolanti in una CALT proposta da Siliciano, se avesse un qualche effetto sul reservoir?

[Dora]

Cioè sono passati direttamente dallo studio in vitro a quello ex vivo su esseri umani senza passare per i modelli animali? Se i risultati in vitro erano già così ambigui, nella sperimentazione ex vivo sarà l'ennesimo fallimento!

Io di studi su modelli animali, in particolare su scimmie, non ne ho trovati. Magari ho cercato male, ma vedo solo studi su cellule.
Quando uscì il lavoro di Wender sui bryologs, si disse che a Stanford stavano iniziando a sperimentarli in vivo su animali, ma ancora non mi è capitato di leggere alcun articolo.
Devi però tener conto che, mentre sulla latenza di HIV appunto pare che abbiano lavorato (quasi?) esclusivamente su cellule, la briostatina-1 viene sperimentata in fase clinica per diverse altre malattie. Quindi immagino che la fase dei modelli animali possa per l'HIV essere saltata.
Ciò nonostante, il mio problema è che tutte le sostanze anti-latenza che sulle linee cellulari sembravano fare meraviglie e anche sulle cellule prelevate ex vivo a persone con HIV in terapia avevano comunque riattivato bene la trascrizione virale, quando poi sono finalmente state date in vivo ad esseri umani non è che abbiano dato chissà che soddisfazioni. Quindi mi chiedo che cosa ci possiamo aspettare da una sostanza che fin dalle cellule ha avuto un comportamento capriccioso. Forse non era strettamente necessario per avere l'approvazione dei comitati etici, ma non potevano comunque fare prima un bello studio sui macachi?

Al limite la briostatina potrebbe essere anche usata assieme alle altre sostanze anti-latenza circolanti in una CALT proposta da Siliciano, se avesse un qualche effetto sul reservoir?

Sì, questa è l'idea degli spagnoli, che hanno visto che se la si somministra insieme a un HDACi (debolissimo) come l'acido valproico si riescono a sfruttare contemporaneamente due diversi meccanismi che portano alla riattivazione della trascrizione del virus latente.
In ogni caso, che la briostatina-1 sia una potente sostanza anti-latenza ce lo dicono non solo gli spagnoli che ne sono innamorati, ma anche molti altri studi, fra cui quelli di Siliciano (vedi anche l'ultimo lavoro che arriva dal Siliciano Lab - New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo).

Se nel weekend trovo il tempo, provo ad approfondire la questione, perché anch'io sono stata colta alla sprovvista dall'inizio di questo trial, tanto più dopo la conclusione dell'ultimo articolo di Siliciano:

• The new assays presented herein facilitated what is to our knowledge the first comparative ex vivo evaluation of candidate LRAs [latency reversing agents]. Our data demonstrate that none of the leading candidate non–T cell–activating LRAs tested significantly disrupted the latent reservoir ex vivo. The discordance between the effects of nonstimulating LRAs in in vitro models of HIV-1 latency and their effects ex vivo in resting CD4+ T cells from infected individuals on ART indicates that these models do not fully capture all mechanisms governing HIV-1 latency in vivo. These compounds are unlikely to drive the elimination of the latent reservoir in vivo when administered individually. The only effective single agent was the PKC agonist bryostatin-1, which is probably too toxic for clinical use. Whether other PKC agonists or other compounds that stimulate signaling pathways associated with T cell activation can be safely administered to patients remains to be seen, and further progress may depend on finding safe and active combinations of LRAs.

[Keanu]

Ciò nonostante, il mio problema è che tutte le sostanze anti-latenza che sulle linee cellulari sembravano fare meraviglie e anche sulle cellule prelevate ex vivo a persone con HIV in terapia avevano comunque riattivato bene la trascrizione virale, quando poi sono finalmente state date in vivo ad esseri umani non è che abbiano dato chissà che soddisfazioni. Quindi mi chiedo che cosa ci possiamo aspettare da una sostanza che fin dalle cellule ha avuto un comportamento capriccioso. Forse non era strettamente necessario per avere l'approvazione dei comitati etici, ma non potevano comunque fare prima un bello studio sui macachi?

Ogni patologia credo sia un caso a sé,una sostanza può funzionare bene per l'una ma non per l'altra. Ma visto che la briostatina-1 già è usata nella clinica di altre patologie e quindi se ne conoscono i profili di tossicità, avranno preferito saltare lo studio sui macachi e applicarla direttamente agli esseri umani per vedere effettivamente su di essi i suoi (dubbi) effetti. Staremo a vedere cosa ne uscirà alla fine del trial.

Sì, questa è l'idea degli spagnoli, che hanno visto che se la si somministra insieme a un HDACi (debolissimo) come l'acido valproico si riescono a sfruttare contemporaneamente due diversi meccanismi che portano alla riattivazione della trascrizione del virus latente.
In ogni caso, che la briostatina-1 sia una potente sostanza anti-latenza ce lo dicono non solo gli spagnoli che ne sono innamorati, ma anche molti altri studi, fra cui quelli di Siliciano (vedi anche l'ultimo lavoro che arriva dal Siliciano Lab - New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo).

Se nel weekend trovo il tempo, provo ad approfondire la questione, perché anch'io sono stata colta alla sprovvista dall'inizio di questo trial, tanto più dopo la conclusione dell'ultimo articolo di Siliciano:

• The new assays presented herein facilitated what is to our knowledge the first comparative ex vivo evaluation of candidate LRAs [latency reversing agents]. Our data demonstrate that none of the leading candidate non–T cell–activating LRAs tested significantly disrupted the latent reservoir ex vivo. The discordance between the effects of nonstimulating LRAs in in vitro models of HIV-1 latency and their effects ex vivo in resting CD4+ T cells from infected individuals on ART indicates that these models do not fully capture all mechanisms governing HIV-1 latency in vivo. These compounds are unlikely to drive the elimination of the latent reservoir in vivo when administered individually. The only effective single agent was the PKC agonist bryostatin-1, which is probably too toxic for clinical use. Whether other PKC agonists or other compounds that stimulate signaling pathways associated with T cell activation can be safely administered to patients remains to be seen, and further progress may depend on finding safe and active combinations of LRAs.

La briostatina sarà pure potente come sostanza anti-latenza, ma sempre in vitro. Evidentemente ex vivo subentra qualche altro meccanismo che la scienza ancora non ha individuato.Speriamo che Siliciano lo individui!
Dora, sai perché gli spagnoli hanno optato per l'acido valproico e non per una sostanza con più efficacia anti-latenza? Tra l'altro se non erro, Siliciano nella CALT proponeva non un paio ma più sostanze anti-latenza che lavorino su più fronti.Se si usassero troppe sostanze anti-latenza si rischierebbe la cd. tempesta di citochine vero?

[Dora]

Dora, sai perché gli spagnoli hanno optato per l'acido valproico e non per una sostanza con più efficacia anti-latenza?

Ne hanno testati tre di HDACi, insieme alla briostatina-1: acido valproico, tricostatina e butirrato di sodio.

• We found that treatment of Jurkat-LAT-GFP cells with increasing concentrations of the HDAC inhibitors for 24 h resulted only in slight reactivation of latent HIV-1 (the highest percentages of GFP positive cells were found with TSA at 400 nM and NaBut at 5 mM, reaching 21.4% and 17,8% respectively) (Table 1). Bryostatin-1 at the concentration of 1 nM did not antagonize HIV-1 latency but in the presence of each HDAC inhibitors clearly induced HIV-1 reactivation (29.7, 50.2, and 54% GFP+ cells respectively for VPA, TSA and NaBut). This synergistic activity was also found using 10 nM of bryostatin-1 and the HDAC inhibitors at all the concentrations tested (Table 1).
  
  

Quando gli spagnoli hanno pubblicato il loro lavoro sulla briostatina, già si sapeva che l'acido valproico non aveva fatto nulla al reservoir di HIV quando era stato dato in vivo. Tieni però conto che nel 2009-10 l'unico HDACi ad essere già stato sperimentato su persone con HIV era proprio l'acido valproico (Margolis stava iniziando in quel momento il primo, piccolissimo, trial sul vorinostat, mentre panobinostat e romidepsina erano molto di là da venire).

• HDAC inhibitors, which are in the first line for the development of cancer therapies, can reactivate HIV-1 latency in vitro. A recent proof of concept study has shown that valproic acid (VPA), an HDAC inhibitor, induced a significant depletion of HIV-1 latent infected cells in three of four patients included in the study [questo era un trial proof of concept fatto da Margolis]. However, other clinical studies failed to demonstrate a decline in the HIV-1 reservoir and concluded that the clinical use of VPA has no ancillary effect on the decay of the latent reservoir [Janet Siliciano dimostrò che Margolis doveva aver fatto qualche pasticcio]. Besides VPA there are no clinical reports regarding the use of other HDAC inhibitors for the treatment of HIV-1 latency, but it is likely that single therapy with HDAC inhibitors will not be sufficient to reactivate latent HIV-1 from the patient viral reservoir and a more potent therapy will be required to purge HIV-1 in patients [come in effetti abbiamo visto in questi anni].
  Different in vitro analyses are suggesting that combination therapies targeting distinct molecular targets could be a good option to eradicate HIV-1. For instance, a combination with NF-B activators including prostratin plus HDAC inhibitors proved to be superior to either drug separately [ma la prostratina in fase clinica ancora non ci è arrivata][...]

Tra l'altro se non erro, Siliciano nella CALT proponeva non un paio ma più sostanze anti-latenza che lavorino su più fronti.Se si usassero troppe sostanze anti-latenza si rischierebbe la cd. tempesta di citochine vero?

Nussenzweig ai suoi topi ha dato tre sostanze anti-latenza insieme (+ bNAbs) e ha avuto un ottimo risultato. Ma parliamo di topi.

[Dora]

È iniziato il trial sulla briostatina (finalmeeenteee!)

• Bryostatin-1 Effect on HIV-1 Latency and Reservoir in HIV-1 Infected Patients Receiving Antiretroviral Treatment (BRYOLAT)

Iscritto la settimana scorsa, da ieri [22 ottobre 2014] ha iniziato il reclutamento dei pazienti e si terrà sotto la supervisione di Santiago Moreno e Carolina Gutierrez a Madrid, presso l'Hospital Universitario Ramon y Cajal.
È un trial molto, molto prudente: di fase I, randomizzato, in doppio cieco e controllato con placebo e ha l'obiettivo di trovare il giusto dosaggio di briostatina 1 (somministrata un'unica volta). Ne verranno sperimentati due - 10ug/m2 e 20ug/m2 - e verranno messi a confronto con un placebo per indagare l'effetto anti-latenza sul reservoir di HIV di persone in terapia antiretrovirale.

Obiettivo primario è:

• - la misurazione dei livelli di HIV RNA intracellulare (usRNA e msRNA) dopo la somministrazione di briostatina 1 (al basale e nei giorni 2 e 3 dopo il trattamento).

Obiettivi secondari sono:

• - la misurazione dei livelli di HIV RNA: di partenza, al giorno 0 (15, 30, 60 minuti e 1, 2, 4, 8, 12 ore dopo la somministrazione), e nei giorni 1, 2 e 3;
  - i livelli di CD4 e CD8;
  - il livello del DNA episomale misurato in base ai circoli 2 LTR (al basale e nei giorni 2 e 3 dopo il trattamento);
  - gli eventuali eventi avversi (al basale e fino a 28 giorni dopo la somministrazione).

I pazienti previsti sono 12, in terapia antiretrovirale con almeno 3 farmaci e da almeno 2 anni, con viremia costantemente irrilevabile secondo test ultrasensibili, senza mai blip superiori alle 200 copie o fallimenti virologici e almeno 350 CD4.

il completamento della raccolta dei dati sull'obiettivo primario è previsto per ottobre 2015 e la fine dello studio per ottobre 2016.

RISULTATI NON PROPRIO ESALTANTI DELLA PRIMA SPERIMENTAZIONE CLINICA SULLA BRIOSTATINA-1 IN FUNZIONE ANTILATENZA

Come da tabella di marcia, lo scorso autunno si è conclusa la prima parte del trial sulla briostatina e oggi Santiago Moreno e colleghi del Ramón y Cajal Unversity Hospital di Madrid pubblicano su AIDS i risultati della sperimentazione – che esattamente come i primi studi pilota sugli HDACi ha dato tranquillizzanti informazioni sul profilo di sicurezza del farmaco studiato, ma un risultato molto deludente sulla sua efficacia come sostanza anti-latenza.

Gli studi in vitro fatti in questi anni avevano tutti indicato una forte capacità della briostatina di riattivare la trascrizione dell’HIV latente mediante l’attivazione della PKC e la sua capacità superiore rispetto agli HDACi di causare aumenti significativi di HIV RNA associato alle cellule nei CD4 prelevati da persone in terapia soppressiva. Inoltre, avevano mostrato la sua capacità di operare in sinergia con gli HDACi, inducendo nelle cellule produzione e rilascio di virioni in quantità statisticamente significative. Il tutto senza quasi causare produzione di citochine, quindi con la promessa di evitare gravi tossicità una volta che venisse testata in vivo.

Il vero problema affrontato da Moreno e colleghi in questa sperimentazione è stata l’assenza di una chiara idea su quanta briostatina serva per ottenere qualcosa in persone con viremia soppressa stabilmente dalla ART – questo anche per la mancanza di test affidabili per quantificare i livelli del farmaco nel siero e valutarne la farmacocinetica.

Sono quindi andati un po’ alla cieca, contando sul fatto che nei trial di fase II e III sui pazienti con cancro o Alzheimer i dosaggi dati sono molto più alti (da 25 a 65 μg/m2 in infusioni o di 1 ora o di 24 ore, per settimane), somministrando una sola infusione della durata di 1 ora o di 10μg/m2 o di 20μg/m2 a due gruppi di 4 pazienti scelti a caso, mentre ad altri 4 hanno dato un placebo.

Tutta questa prudenza si è rivelata vincente sul fronte di sicurezza e tossicità, perché tutti i partecipanti hanno mantenuto la viremia sotto le 50 copie, i CD4 sopra i 350 e hanno completato lo studio senza presentare anomalie ematologiche o nei parametri di laboratorio e lamentando effetti avversi trascurabili e risoltisi spontaneamente:



Purtroppo, però, ai dosaggi dati la briostatina al reservoir non ha fatto NIENTE (letteralmente):

• 1. le sue concentrazioni nel plasma si sono mantenute molto al di sotto di quella che è ritenuta la soglia necessaria per riattivare l’HIV latente usando un singolo farmaco;
  
  2. ai dosaggi dati la briostatina non è riuscita ad attivare la PKC, quindi come ci si può facilmente attendere:
  
  3. i livelli di HIV RNA associato alle cellule sono rimasti inalterati ad entrambi i dosaggi:
  
  
  
  4. e tanto più lo stesso è avvenuto ai livelli di HIV RNA nel plasma:
  
  
  
  5. Fortunatamente, non è stato pagato un prezzo in termini di attivazione e infiammazione per questo fallimento: i marker infiammatori valutati (sCD14 e IL-6) sono rimasti invariati.

Insomma, tanta prudenza per nulla.

Ora, è vero che il profilo di sicurezza del farmaco ai dosaggi indagati è buono. Ma che cosa accadrebbe se se ne usasse di più? È il solito trade-off che impone una scelta sbagliata: non dai un farmaco solo perché non fa male, tu vuoi che dimostri anche di essere efficace.
Moreno e colleghi ovviamente pensano di usare la briostatina in combinazione con HDACi, perché ormai l’idea della cALT (terapia combinata antilatenza) sta seducendo tutti. Quindi forse la briostatina continuerebbe ad essere somministrata a dosaggi molto bassi.
Ma se non innesca il meccanismo della PKC, a che serve?

In breve, serviranno altri studi per capire se la grande potenza dimostrata ex vivo dalla briostatina potrà venir buona in vivo in qualche strategia di cura.

Gli spagnoli pensano di fare un trial di fase I/II o con un singolo dosaggio, ma più alto, o con dosaggi multipli ascendenti, per stabilire sicurezza, tollerabilità e efficacia della briostatina nel riattivare l’HIV latente nel sangue e nei tessuti linfatici dell’intestino.

Avanti così, sempre con calma, ché tanto la cura può aspettare.


Invocazione (un po' esasperata) di Dora: cara professoressa Barré-Sinoussi, dal momento che lei ha idee molto chiare e molto condivisibili su come andare avanti, metta tutto il suo prestigio perché questa gente si dia una mossa!




FONTE:
- articolo di C. Gutiérrez et al. su AIDS: Bryostatin-1 for latent virus reactivation in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a phase i, double-blind clinical trial

[Blast]

che peccato! Sembrava uno studio promettente. Forse bisogna studiare un po' meglio l'eventuale combinazione con le istone-deacetilasi, che sono state ben caratterizzate dalla biologia molecolare ormai da anni. In qualche modo devono potersi svegliare e trascrivere ste maledette resting CD4!

[Keanu]

Ennesimo fallimento! Spero che la scienza inizi a dare presto qualche risposta in più perché sono troppe le persone che non credono all'HIV e che continuano a diffonderlo. Così i negazionisti chiuderanno la loro boccaccia!

[Dora]

che peccato! Sembrava uno studio promettente. Forse bisogna studiare un po' meglio l'eventuale combinazione con le istone-deacetilasi, che sono state ben caratterizzate dalla biologia molecolare ormai da anni. In qualche modo devono potersi svegliare e trascrivere ste maledette resting CD4!

Giocarsi la briostatina dopo i risultati ottimi che ha avuto negli studi preclinici sarebbe da pazzi.
Questi ricercatori sono prudenti al limite della pavidità e sembrano pensare di avere tutto il tempo del mondo per fare i loro studi su come calibrare le dosi.
Devono darsi una mossa, di studi pilota ormai ne sono stati fatti decine e devono accettare la saggezza della Barré-Sinoussi: basta trial basati su una sola sostanza antilatenza, altrimenti passerà un secolo prima che ci sia uno straccio di cura.
Per esempio, vogliono capire la dose minima di briostatina necessaria a smuovere il reservoir? impostino un trial in più fasi: nella prima, diano tre dosi molto diverse a tre persone (contemporaneamente, eh? non una dopo l'altra come hanno fatto adesso). Poi, se si vede in vivo un effetto anti-latenza, passino immediatamente a testare il dosaggio efficace su un maggior numero di persone. Ma insieme diano almeno un HDACi. E prevedano immediatamente un braccio con anche un vaccino terapeutico o un agonista di qualche TLR o quel che vogliono.
Non mi sembra un tipo di trial irrealizzabile. Solo che finché continuano ad aver paura di respirare è difficile che vadano lontani.
Ecco, l'ho detto. Cerco sempre di tenermi per me la frustrazione e di ammorbidire i toni, ma 'sta volta sono proprio furiosa.

[Dora]

che peccato! Sembrava uno studio promettente. Forse bisogna studiare un po' meglio l'eventuale combinazione con le istone-deacetilasi, che sono state ben caratterizzate dalla biologia molecolare ormai da anni. In qualche modo devono potersi svegliare e trascrivere ste maledette resting CD4!

Giocarsi la briostatina dopo i risultati ottimi che ha avuto negli studi preclinici sarebbe da pazzi.
Questi ricercatori sono prudenti al limite della pavidità e sembrano pensare di avere tutto il tempo del mondo per fare i loro studi su come calibrare le dosi.
Devono darsi una mossa, di studi pilota ormai ne sono stati fatti decine e devono accettare la saggezza della Barré-Sinoussi: basta trial basati su una sola sostanza antilatenza, altrimenti passerà un secolo prima che ci sia uno straccio di cura.
Per esempio, vogliono capire la dose minima di briostatina necessaria a smuovere il reservoir? impostino un trial in più fasi: nella prima, diano tre dosi molto diverse a tre persone (contemporaneamente, eh? non una dopo l'altra come hanno fatto adesso). Poi, se si vede in vivo un effetto anti-latenza, passino immediatamente a testare il dosaggio efficace su un maggior numero di persone. Ma insieme diano almeno un HDACi. E prevedano immediatamente un braccio con anche un vaccino terapeutico o un agonista di qualche TLR o quel che vogliono.
Non mi sembra un tipo di trial irrealizzabile. Solo che finché continuano ad aver paura di respirare è difficile che vadano lontani.
Ecco, l'ho detto. Cerco sempre di tenermi per me la frustrazione e di ammorbidire i toni, ma 'sta volta sono proprio furiosa.

IL MARAVIROC COME NUOVA SOSTANZA ANTI-LATENZA?

Un primo, interessante passo fatto da Santiago Moreno in direzione dell'uso combinato di sostanze anti-latenza diverse e riferito ad AIDS 2016 è stato uno studio in vitro delle capacità anti-latenza del maraviroc (un vecchio cavallo di battaglia di Moreno) e delle sue possibili sinergie con la briostatina: Reversal of HIV-1 latency with maraviroc alone or in combination with bryostatin-1 + POSTER.

Volevano capire se il maraviroc, che è un inibitore del CCR5 e ha la capacità di attivare l'espressione dei geni correlati all'NF-kB (lo stesso percorso che porta alla trascrizione del virus latente ed è stimolato dalla briostatina), può funzionare come sostanza anti-latenza e, se sì, se il somministrarlo insieme alla briostatina potenzia l'effetto di entrambi.

Il loro modello di latenza erano CD4 primari quiescenti e linfociti T della memoria centrale prelevati a persone HIV negative.
Li hanno pre-trattati con CCL 19 o con IL-7 e poi li hanno infettati o con un virus X4 (X4-NL4.3) o con un virus R5 (R5-Bal), hanno aspettato 5 giorni che il virus andasse in latenza e hanno misurato la quantità di HIV DNA integrato.
Poi hanno stimolato le cellule con diverse concentrazioni di maraviroc da solo o insieme a quantità crescenti di briostatina e dopo 18 ore sono andati a cercare l'antigene p24, che doveva dire se il virus latente era stato risvegliato, oppure no.

Oltre ad aver trovato la dose di maraviroc che ritengono utile per i prossimi studi, quel che hanno osservato è che IL MARAVIROC È STATO EFFICIENTE QUANTO LA BRIOSTATINA NEL RIATTIVARE IL VIRUS (sia il virus X4-tropico, sia il virus R5), TUTTAVIA LE DUE SOSTANZE NON HANNO AGITO IN SINERGIA.
Inoltre, la riattivazione ha raggiunto la significatività statistica nel modello di cellule trattate con interleuchina-7, non in quelle trattate con CCL 19.

In sintesi:

• - il maraviroc aumenta l'attivazione dipendente dall'LTR e la replicazione di HIV nei CD4 quiescenti senza aumentare la tossicità cellulare;
  - il maraviroc incrementa la replicazione di HIV nei CD4 con una potenza simile a quella della briostatina;
  - il maraviroc inverte la latenza di HIV-1 sia che questo sia di tipo X4, sia che sia di tipo R5;
  - il trattamento combinato con maraviroc e briostatina non è soltanto non sinergico, ma addirittura inibitorio, almeno sulla replicazione di virus X4.

Quindi, secondo Moreno e colleghi, il maraviroc dovrebbe essere considerato - quanto meno in vitro - una sostanza anti-latenza a tutti gli effetti e con una attività simile a quella della briostatina, anche se di usarlo insieme alla briostatina non è proprio il caso.


NdD: una sperimentazione portata ad AIDS 2016, che ha visto insieme l'uso di maraviroc, vorinostat e idrossiclorochina, non ha dimostrato nessun effetto rilevante sul reservoir. Raccontata nel thread Idrossiclorochina contro l'immunoattivazione? NO GRAZIE!

[Dora]

SUW133: UN BRYOLOG - ANALOGO DI SINTESI DELLA BRIOSTATINA-1 - FINALMENTE SPERIMENTATO IN VIVO IN UN MODELLO DI TOPI

Arriva su PLoS PATHOGENS In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication, un articolo che aspettavo da anni e in cui prosegue la collaborazione fra il gruppo di Stanford di Paul Wender che ha creato i bryologs e Jerome Zack e colleghi che, alla UCLA, studiano per trovare una cura di HIV.

Come raccontato all'inizio di questo thread, la briostatina-1 è parte della famiglia di 21 briostatine, sostanze estratte da un briozoo marino, la Bulgula neritina. Poiché è una sostanza dalle molte proprietà potenzialmente terapeutiche - nel caso della cura di HIV, favorisce la trascrizione del virus latente modulando la protein-chinasi C (PKC) a concentrazioni nanomolari - si è cercato di farla di sintesi, dal momento che l'estrazione della sostanza naturale dalla Bugula è complicata e costosa non solo dal punto di vista economico, ma anche ecologico, perché mette a rischio l'ecosistema di cui il briozoo è parte.

Si è già visto che in vitro la briostatina-1 è molto potente. Inoltre, uno studio clinico di fase I ha dimostrato che somministrata a basse dosi è sicura, ma che servono dosaggi più alti per ottenere un'inversione della latenza del virus mediata dalla PKC.
Questa è la ragione per cui Wender ha creato degli analoghi di sintesi efficaci a dosaggi molto più bassi della briostatina-1 naturale, appunto i "bryologs", uno dei quali - SUW133 - è stato scelto per studiarne la tollerabilità e la capacità di inversione della latenza in vivo in un modello di topi umanizzati (BLT - bone marrow, liver, thymus).

Prima hanno testato questo briologo su CD4 latentemente infetti prelevati a 6 persone con HIV soppresso dalla ART e hanno visto che induceva a trascriversi livelli significativi di virus.

Poi hanno confrontato la potenza del SUW133 nel riattivare il reservoir di altre 3 persone in terapia con altre sostanze anti-latenza (gli HDACi vorinostat e panobinostat, l'inibitore del bromodominio BET JQ1, la briostatina-1 che modula la PKC) e con la stimolazione con anticorpi anti-CD3+anti-CD28, che è il modo per ottenere la più massiccia attivazione dei CD4 quiescenti e quindi la massima trascrizione possibile (ed è assolutamente troppo tossico perché lo si possa utilizzare in vivo). In questi esperimenti, hanno visto che il SUW133 funzionava molto meglio delle altre sostanze nel forzare la trascrizione del virus latente e induceva 1/3 di virioni di HIV rispetto a quanti ne induceva la massima stimolazione possibile dei CD4.

Dopo di che, hanno fatto un ragionamento molto interessante, in cui io è la prima volta che mi imbatto, ma che naturalmente potrebbe essere ovvio per gli esperti: sia la briostatina, sia la prostratina (che sfrutta lo stesso meccanismo della PKC per stimolare la trascrizione del virus), possono indurre i CD4 ad esprimere un certo marker di attivazione: il CD69. E si è osservato che anche il SUW133 sovraregola l'espressione di questo marker sulla superficie dei CD4.
Questo, secondo Zack e colleghi, indica che il CD69 può essere usato come marker in vivo per stabilire quando sono state somministrate concentrazioni biologicamente attive di una certa sostanza e quindi lo si può utilizzare per valutare la potenza relativa di quella sostanza.
Per capire se il SUW133 è più potente della briostatina-1, li hanno somministrati a dei topi in dosi via via crescenti e ne hanno così valutato l'attività e la tossicità relative, osservando che l'analogo di sintesi offre una "finestra terapeutica" più ampia rispetto alla sostanza naturale: questo significa che se ne può somministrare molto di meno per ottenere lo stesso effetto terapeutico. E anche che lo si può somministrare più volte, avendo meno tossicità.

Infine: l'esperimento sui topi umanizzati, forti del fatto che la stretta correlazione osservata fra inversione della latenza virale e sovraregolazione del CD69 suggeriva che il SUV133 doveva essere capace di indurre l'espressione dell'HIV latente anche in vivo.
E in effetti così è stato.



Hanno infettato dei topi BLT con una variante di virus capace di replicarsi, ma modificata in modo da far esprimere una certa proteina sulla superficie delle cellule produttivamente infette e così renderle facilmente riconoscibili. Poi hanno trattato i topi con ART e, quando la viremia è stata stabilmente soppressa, hanno loro somministrato il SUV133. Poi li hanno sacrificati e hanno contato la percentuale di cellule presenti nel sangue e nella milza che esprimevano la *proteina-segnale di cellula infetta* e con virus attivamente replicante, mettendo a confronto queste percentuali con quelle contate in topi di controllo, trattati con la sola ART.
E quel che si è visto è che il SUW133 aveva indotto numeri significativi di cellule latentemente infette a esprimere proteine virali.

Non si sono fermati qui, perché volevano anche capire se l'attivazione indotta dalla loro sostanza anti-latenza era capace di distruggere abbastanza cellule, che fosse per gli effetti citopatici del virus o per le risposte immuni dei CD8 e delle cellule NK.
Hanno così usato dei coloranti dai nomi meravigliosi (rosso fantasma e giallo zombie), che non si vedono quando le membrane delle cellule sono intatte e invece attribuiscono loro colore quando sono morte o morenti, e hanno potuto osservare che, a 24 ore dalla attivazione, il 25% delle cellule che il SUW133 aveva obbligato a produrre virus erano color rosso-fantasma o giallo-zombie, mentre quelle che non esprimevano la *proteina-segnale di cellula produttivamente infetta* continuavano ad essere vive e vegete.

Questo dimostra una cosa molto interessante: che l'analogo della briostatina-1 sperimentato qui non funziona solo come stimolo alla trascrizione del virus ("kick"), ma fa morire anche le cellule infette riattivate, senza che intervengano altre sostanze per la parte del "kill".
Potrebbe essere una risposta alla questione fondamentale posta da questo approccio alla cura - se basti riattivare una quota sufficiente del reservoir latente perché s'inneschi un ciclo *virtuoso* di uccisione delle cellule infette?
È presto per dirlo. Ma dobbiamo anche ammettere che gli studi clinici fatti finora con le sostanze anti-latenza sono stati così deludenti proprio perché di reservoir se ne riattivava troppo poco e la quantità di proteine virali che venivano prodotte era troppo bassa per scatenare gli effetti citotossici del virus o del sistema immunitario.
Quindi questa potrebbe ben essere una strada giusta. Certamente una strada da provare a percorrere.
Ci sono ancora diverse cose da capire:

• - I provirus riattivati dal SUW133 che roba erano? Intatti e dunque pericolosi, oppure incapaci di replicarsi e dunque solo robaccia che contribuisce all'nfiammazione, ma non è in grado di stabilire nuovi cicli di infezione? Erano forse parte di quel reservoir che abbiamo visto essere refrattario al primo ciclo di riattivazione e che preferisce restarsene a dormire ancora per un po', per poi risvegliarsi quando meno uno lo vorrebbe?
  - Che cosa succede al reservoir se lo si obbliga a riattivarsi somministrando sostanze anti-latenza in diversi cicli ripetuti?
  - Quali sono gli effetti a lungo termine dell'indurre piccoli livelli di attivazione (come quelli visti con la sovraregolazione del CD69) ma sostanzialmente in tutti i linfociti T presenti in vivo? Non c'è la tempesta di citochine scatenata da una attivazione massiccia, ma possiamo escludere tossicità acute?

Tutte domande cui si dovrà dare risposta nei prossimi tempi.