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MessaggioInviato: martedì 24 febbraio 2015, 18:52 
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La lezione che John Coffin, Tuft University, ha tenuto ieri durante il Workshop for New Investigators and Trainees ci introduce alle molte relazioni che ascolteremo sulla ricerca di una cura. Sono argomenti che seguiamo regolarmente, quindi non credo che Coffin ci dirà qualcosa di inaudito, ma la sua è stata una lezione molto chiara, che ha il pregio di sintetizzare i temi di cui abbiamo discusso in un gran numero di thread.


HIV Cure Research

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L’esordio di Coffin è il riconoscimento che i farmaci antiretrovirali sono uno dei miracoli della medicina moderna. Nonostante siano un miracolo, però, non fanno miracoli. Infatti, l’unica persona di cui sappiamo con certezza che era infetta da HIV e che ora non lo è più è Timothy Brown, noto come il Berlin Patient.
La sua storia la conosciamo bene, quindi mi limito a ricordarla per sommi punti attraverso questa slide:

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La terapia antiretrovirale, anche se non cura l’infezione, è comunque estremamente efficace nel controllarla: nel giro di poche settimane causa un rapido declino della viremia nel plasma; seguono periodi di più lento declino, durante i quali la viremia si mantiene al di sotto dei livelli di rilevabilità dei test standard. Se però la terapia viene interrotta, il virus ha un rebound piuttosto rapido e torna più o meno agli stessi livelli sui quali si era assestato prima dell’inizio della ART, magari anche dieci anni prima. Questo rebound è quello che impedisce alla terapia di essere una cura.

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Coffin passa così a spiegare la natura del reservoir, dandone una definizione molto restrittiva:

    - il termine “reservoir” dovrebbe essere usato solo alle cellule e al virus che si ripresenta quando la ART viene sospesa;
    - la persistenza in sé non può essere attribuita alla replicazione attiva del virus. Il reservoir deve dunque consistere di cellule che sono longeve e che contengono dei provirus dell’HIV non difettivi, in uno stato che non è espresso, ma che è inducibile (“latente”);
    - queste cellule non sono create dalla ART, né sono indotte ad esprimere il virus dalla cessazione della ART;
    - sono solo una piccola parte del totale delle cellule che contengono DNA virale (forse l’1%, o anche meno), la grande maggioranza delle quali contengono provirus difettivi, alcuni dei quali possono essere espressi come RNA;
    - NON si può ritenere che la maggioranza delle cellule DNA positive riflettano le caratteristiche di quelle cellule infette che costituiscono il reservoir (bisogna quindi stare molto attenti quando si interpretano i risultati di esperimenti che valutano il DNA virale presente nelle cellule);
    - circa 1 su 1 milione di CD4 quiescenti contengono dei provirus che possono essere indotti da esperimenti ex vivo. Che dire di altri tipi di cellule? Forse i macrofagi?

Se invece che all’RNA virale guardiamo al DNA (linea gialla nella slide), che cosa accade quando si inizia la ART?
Il suo destino è molto diverso da quello dell’RNA:

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Entrambi declinano rapidamente subito dopo l’inizio della ART, ma mentre l’RNA crolla di più di 10.000 volte, il livello del DNA cala di circa 10 volte rispetto ai valori di prima della terapia.
Questo significa che solo una piccolissima frazione delle cellule che contengono DNA virale (meno di 1 su 100) sono coinvolte nella produzione persistente di virus durante la ART.
Questa minuscola frazione comprende il reservoir che ridà inizio all’infezione quando la terapia viene sospesa.

Coffin passa poi a descrivere il “modello standard” della latenza dell’HIV:

    - la grande maggioranza delle cellule infette muore nel giro di pochi giorni;
    - una piccola minoranza di cellule infette entra in uno stato di quiescenza che – per molte possibili ragioni, non tutte note - sopprime l’espressione del provirus;
    - una grande minoranza di cellule sono infette con provirus che presentano delle mutazioni che li disattivano;
    - queste cellule sono molto longeve e possono essere stimolate ad espandersi mediante segnali antigenici o omeostatici;
    - i provirus latenti intatti rilasciano piccole quantità di virus, sia in modo continuo, sia più verosimilmente con delle esplosioni che fanno seguito a qualche tipo di stimolo;
    - queste possono essere rilevate ex vivo se si attivano i CD4 quiescenti estratti da persone che sono in terapia da lungo tempo.

Questa slide mostra la dinamica dell’HIV DNA prima e dopo la ART:

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Il problema è che mentre le cellule produttivamente infette muoiono rapidamente, quelle latentemente infette – che contengano o meno provirus in grado di riattivarsi – si accumulano nel tempo.

Si può dunque visualizzare così il DNA virale nelle cellule che vivono più a lungo:

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I provirus che possono essere indotti sono pochissimi, ma per arrivare all’eradicazione bisogna riuscire ad eliminarli tutti.

Coffin passa poi a descrivere le proprietà generali dei retrovirus, HIV compreso:

    - si replicano attraverso DNA intermedio stabilmente integrato;
    - il ciclo di replicazione è in qualche modo soggetto ad errori, che comportano mutazioni, così HIV accumula diversità durante ripetuti cicli di replicazione;
    - il provirus integrato si replica insieme al DNA della cellula ed è geneticamente molto stabile;
    - pertanto, uno specifico provirus può “etichettare” i cloni di cellule infette e può sopravvivere quanto sopravvive la cellula infetta;
    - l’espressione dei provirus per creare virus può essere regolata dalla struttura della cromatina e da altre caratteristiche epigenetiche;
    - la ART blocca l’infezione e la formazione del provirus, ma non ha alcun effetto sulle cellule che sono già state infettate;
    - questo consente lunghi periodi di sopravvivenza dell’infezione nelle cellule latentemente infette più longeve;
    - una questione aperta è se i provirus dell’HIV stessi influenzino la sopravvivenza e la crescita delle cellule in base ai siti di integrazione.

Se solo una piccolissima parte delle cellule DNA positive sono infettate da virus capace di riattivarsi, diventa molto difficile identificare la fonte del rebound del virus quando viene sospesa la ART:

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Volendo caratterizzare quello che Coffin chiama “stadio stazionario persistente”, abbiamo che

    - nel periodo che precede la ART abbiamo un gran numero di cellule poco longeve, in cui il provirus muore in fretta, e una relativamente più piccola frazione di cellule che hanno una vita più lunga, in cui il provirus ha una durata corrispondente;
    - l’inizio della ART non influisce sulle cellule infette, ma ha l’effetto di rende più “visibili” quelle che contengono provirus;
    - si ha poi da un lato una graduale per quanto lenta erosione di quelle cellule, dall’altro una proliferazione clonale delle cellule infette sopravvissute, sia grazie a stimolazione antigenica, sia grazie a proliferazione omeostatica;
    - il numero di cellule infette rimane così pressappoco lo stesso; si ha però l’emergere di una popolazione di cloni.

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La slide che segue mostra un esempio dell’espansione clonale di sequenze di RNA (in rosso) e di DNA (in nero) dell’HIV in diversi momenti del tempo. Si tratta di espansione clonale della cellula e non di replicazione clonale del virus e si è osservato che popolazioni clonali diverse di HIV RNA e di HIV DNA appaiono anche dopo vari anni di terapia.

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Ancora l’espansione clonale, questa volta illustrata con un disegnino. Questa espansione clonale, stimolata in questo caso antigenicamente, può dare vita a cellule che contengono virus infettivo, capace di riattivarsi:

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Una questione che verrà ampiamente discussa durante il congresso è quella del sito di integrazione del virus. In alcuni pazienti, se si guardano le cellule mononucleate del sangue periferico infette e messe a coltura, si osserva una particolare distribuzione dei siti di integrazione: mentre in genere si distribuiscono attraverso tanti geni diversi, in questi casi si concentrano in una piccolissima regione del genoma, che si ritiene venga selezionata dall’espansione clonale:

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Come colpire i provirus latenti? L’immagine scelta da Coffin per illustrare la situazione in cui si trova la ricerca non ha bisogno di grandi commenti: l’arciere cieco

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Coffin parla di un lavoro del gruppo di Siliciano uscito l’anno scorso per valutare l’efficacia nel ridurre le dimensioni del reservoir che si richiede a una terapia di inversione della latenza se si vuole rimandare di un mese, 3 mesi … 10 anni o tutta la vita il rebound della viremia dopo la sospensione della ART. Se si riduce il reservoir di 10.000 volte, ci si può attendere il rebound della viremia in un anno. Se si vuole arrivare a una cura accettabile, la riduzione del reservoir deve probabilmente essere nell’ordine delle 100.000 volte (Bo.1 e Bo.2 sono i Boston Patients, Mi. la Mississippi Baby, Be. il Berlin Patient).

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Le strategie di cura che Coffin elenca le conosciamo bene:
    - “Shock and kill” – con l’attivazione del provirus latente continuando la ART, la necessità che o l’espressione virale o la risposta immune uccidano le cellule infette, l’eventuale sospensione della ART;
    - sospensione della ART dopo “immunizzazione” per evitare che il virus ricominci a replicarsi – e quindi terapia genica che renda non infettabili le cellule target, “vaccinazione terapeutica”, somministrazione di anticorpi monoclonali.

E conosciamo bene gli strumenti finora adottati per perseguire quelle strategie: farmaci antilatenza che sfruttano diversi meccanismi d’azione, terapia genica con modificazione delle cellule staminali, vaccinazioni che stimolino le risposte CTL … tutte cose che vedremo nei dettagli durante il congresso. Bastino, allora, le slides:

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Le grandi domande ancora in attesa di una risposta:

    1. In quali cellule si nasconde il reservoir latente? Dov’è? Quanto è grande?
    2. Le cellule latentemente infette sono capaci di espansione clonale?
    3. Una qualsiasi ipotizzabile strategia shock and kill è abbastanza potente da eliminare tutte le cellule latentemente infette (~10^5)?
    4. Se la risposta è no, allora qual è la migliore strategia per bloccare la ricomparsa del virus se la ART viene interrotta?


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MessaggioInviato: martedì 24 febbraio 2015, 19:09 
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Iscritto il: mercoledì 14 gennaio 2015, 18:50
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con grande rispetto verso questo scienziato e tutti gli altri coinvolti nella ricerca di una cura devo dire che non vedo grandi novità. queste slide si conoscono già da un pò di tempo. sappiamo già che è difficile identificare le cellule latentemente infette. conosciamo già l'equazione di siliciano che indica i log di diminuzione necessari e sappiamo che il reservoir è relativamente piccolo e che non riusciamo a misurare accuratamente il virus latente o meglio distinguere quello difettivo da quello replicativo. insomma la stessa zuppa dell'anno scorso riscaldata di nuovo. io speravo in qualche risposta ma per ora non se ne vedono. sembra solo a me o altri hanno questa impressione?


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MessaggioInviato: martedì 24 febbraio 2015, 19:14 
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Datex ha scritto:
con grande rispetto verso questo scienziato e tutti gli altri coinvolti nella ricerca di una cura devo dire che non vedo grandi novità. queste slide si conoscono già da un pò di tempo. sappiamo già che è difficile identificare le cellule latentemente infette. conosciamo già l'equazione di siliciano che indica i log di diminuzione necessari e sappiamo che il reservoir è relativamente piccolo e che non riusciamo a misurare accuratamente il virus latente o meglio distinguere quello difettivo da quello replicativo. insomma la stessa zuppa dell'anno scorso riscaldata di nuovo. io speravo in qualche risposta ma per ora non se ne vedono. sembra solo a me o altri hanno questa impressione?

Con grande rispetto per te, direi che non hai neppure letto l'introduzione al post, che spiegava che cosa sia stata la lezione di Coffin e a chi fosse rivolta. Per la presentazione di lavori originali e (si spera!) innovativi, dobbiamo attendere la continuazione del congresso.


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MessaggioInviato: martedì 24 febbraio 2015, 19:23 
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ok, hai ragione. lo avevi specificato già tu all'inizio.


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MessaggioInviato: martedì 24 febbraio 2015, 19:24 
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la mia preoccupazione è che sia passato un altro anno e che alla fine non abbiamo fatto passi significativi in avanti. spero di sbagliarmi.


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MessaggioInviato: martedì 24 febbraio 2015, 19:32 
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Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48
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Datex ha scritto:
la mia preoccupazione è che sia passato un altro anno e che alla fine non abbiamo fatto passi significativi in avanti. spero di sbagliarmi.

Da quello che ho capito leggendo i titoli dei lavori (per quanto si può capire da un titolo), non ho visto cose esaltanti. In compenso mi pare che ci siano tanti lavori che contribuiscono a definire sempre meglio i problemi. Però sappiamo bene come la ricerca proceda per anni a piccoli passi e poi, accumulando i piccoli passi, arrivi a fare un gran balzo in avanti. Forse non sarà a questo CROI, magari al prossimo.


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MessaggioInviato: giovedì 26 febbraio 2015, 8:13 
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Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48
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La conferenza stampa tenuta al CROI sulla ricerca di una cura e presieduta da John Mellors, University of Pittsburgh School of Medicine:

    - Francesco Simonetti, National Cancer Institute - viremia residua causata da CD4 che infiltrano tumori e si espandono clonalmente;
    - James Whitney, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School - il trattamento con un agonista del TLR7 induce viremia transitoria in macachi con SIV soppresso dalla ART;
    - Jonathan Li, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School - la dimensione del reservoir attivo di HIV predice il momento del rebound virale;
    - John Frater, University of Oxford - biomarker per predire il rebound virale dopo interruzione della ART nello studio SPARTAC.

Del lavoro di Frater abbiamo già parlato a ottobre, quando è uscito l'articolo su eLife dedicato all'HIV DNA totale come marker surrogato del reservoir. Degli altri cercherò di scrivere nei prossimi giorni.





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MessaggioInviato: giovedì 26 febbraio 2015, 21:37 
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Iscritto il: lunedì 20 febbraio 2012, 11:04
Messaggi: 15
Le grandi domande ancora in attesa di una risposta:

1. In quali cellule si nasconde il reservoir latente? Dov’è? Quanto è grande?
2. Le cellule latentemente infette sono capaci di espansione clonale?
3. Una qualsiasi ipotizzabile strategia shock and kill è abbastanza potente da eliminare tutte le cellule latentemente infette (~10^5)?
4. Se la risposta è no, allora qual è la migliore strategia per bloccare la ricomparsa del virus se la ART viene interrotta?


Secondo il mio inesperto e modesto punto di vista, non riesco davvero a capire come si possa pensare a una strategia di cura funzionale dal virus, se gli scienziati ancora non hanno saputo dare una risposta convincente al primo quesito. Se non sai dove si nasconde il tuo nemico come puoi pensare di sconfiggerlo?
Ho come la sensazione che qualche ricerca sia stata fatta seguendo questo strano ragionamento "boh proviamo a fare cosi' dovrebbe funzionare",oppure "sulle scimmie funziona chissa se anche su l'uomo funzionera''" io penso che il vaccino debba passare sicuramente da una conoscenza approfondita alla domanda giustamente posta(la prima).


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MessaggioInviato: sabato 28 febbraio 2015, 10:27 
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Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48
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zimar ha scritto:
Secondo il mio inesperto e modesto punto di vista, non riesco davvero a capire come si possa pensare a una strategia di cura funzionale dal virus, se gli scienziati ancora non hanno saputo dare una risposta convincente al primo quesito. Se non sai dove si nasconde il tuo nemico come puoi pensare di sconfiggerlo?
Ho come la sensazione che qualche ricerca sia stata fatta seguendo questo strano ragionamento "boh proviamo a fare cosi' dovrebbe funzionare",oppure "sulle scimmie funziona chissa se anche su l'uomo funzionera''" io penso che il vaccino debba passare sicuramente da una conoscenza approfondita alla domanda giustamente posta(la prima).

Io non credo che dire "boh proviamo a fare cosi' dovrebbe funzionare" sia una cosa poi tanto strana, o magari disonesta. Anzi, direi che è proprio così che funziona la ricerca: fai delle ipotesi e le metti a confronto con i fatti. Se reggono almeno un po', cerchi di migliorarle, in un gioco continuo di prove e confutazioni. E non le butti via, a meno che tu non abbia in mano qualcosa di meglio, che spieghi meglio quello che osservi e che faccia previsioni più accurate su quello che ti aspetti debba accadere.
Tutte le sperimentazioni cliniche sulla cura che sono state fatte in questi anni erano studi pilota, che servivano proprio a migliorare la teoria che spiega i meccanismi della latenza dell'HIV e come contrastarli. Nessuno ha mai detto "ho la verità in mano, ora ti do questo farmaco e tu torni a casa guarito".
E tutte queste sperimentazioni hanno dato informazioni preziosissime, che stanno via via modificando la teoria, in un continuo rimando fra modelli e realtà.
Non ho la minima idea di quanto ci vorrà prima che le sperimentazioni cliniche si pongano come obiettivo primario la cura e non più l'esplorazione e la ricerca. Forse dovremo attendere ancora qualche anno. Quello che però io ho visto uscire da questo CROI apparentemente privo di risultati che facciano gridare Wow! è una serie di belle ricerche (*), che iniziano a dare risposte alle tantissime domande ancora aperte.
Realisticamente, dubito che ci si possa attendere di più (come al solito, conformare le proprie aspettative alla realtà fuori di noi è faticosissimo e molto doloroso).


(*) Qualche esempio (e forse altri seguiranno - ho ancora moltissimo da vedere):



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MessaggioInviato: martedì 3 marzo 2015, 7:54 
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Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48
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David Margolis e Louis Picker parlano al CROI di ricerca di una cura con Matt Sharp.

Anche a Margolis piace il GS-9620 agonista del TLR7. Conferma l'idea che mi sono fatta che sia la cosa più bella uscita dal CROI di quest'anno sulla cura.

Dunque Picker era a Seattle ...
Negli ultimi giorni, si sono aggiunti un paio di commenti al commento anonimo comparso su PubPeer a gennaio, che demoliva la metodologia adottata nel lavoro su Nature del 2013, le analisi statistiche e la loro interpretazione. Da Picker ancora nessuna reazione ufficiale.
Qualcuno al CROI ha provato a chiedergli conto della critica alla sua ricerca?
O non c'è mai l'occasione giusta per rischiare di essere irrispettosi con uno star researcher, che da mostro sacro rischia di degenerare in vacca sacra?
Fa bene alla salute stare sdraiati in adorazione?





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