[CROI 2012]C. Fletcher: sconfiggere i santuari farmacologici

[Dora]

Durante il simposio “Pathways toward a Cure: Viral Latency and Reservoirs”, oltre alle lezioni di Sharon Lewin e Daria Hazuda sulla latenza e le strategie di eradicazione, c’è stata una interessante conferenza di Courtney Fletcher un farmacologo dell’Università del Nebraska, che io ho seguito con particolare attenzione, perché Fletcher, insieme a Timothy Schacker e Mario Stevenson, è l’autore della ricerca più importante che è stata presentata a St Martin tre mesi fa (http://www.hivforum.info/forum/viewtopi ... 8686#p8686 e http://www.hivforum.info/forum/viewtopi ... 8794#p8794). Avendone potuto leggere allora soltanto gli abstract e il report che ne aveva fatto Jon Cohen per Science, ero molto curiosa di ascoltarlo. E direi che non ha deluso le mie aspettative.

Overcoming Pharmacologic Sanctuaries


Fletcher divide la sua lezione in due parti: nella prima parla dei dati su animali e dei dati che stanno emergendo dagli studi sugli uomini sull’esistenza di “santuari” entro i quali i farmaci faticano ad arrivare; nella seconda discute su come sia possibile distruggere questi “santuari”.

Nella diapositiva che segue, Fletcher mostra la distribuzione degli antiretrovirali nei diversi organi di un animale (vi prego di scusarmi, ma non ho assolutamente capito che animale sia): le zone in blu scuro indicano la concentrazione più bassa di farmaci, il giallo indica la concentrazione più alta. Di qui è evidente che non si ha una distribuzione uniforme di ritonavir. In particolare, la concentrazione nel cervello è minore rispetto a quella che si trova nel fluido cerebrospinale.



Analogamente, nella slide che segue si vede la distribuzione non uniforme di maraviroc e Fletcher fa notare quanto sia bassa nel sistema nervoso centrale e quanto invece questo farmaco penetri bene nel tessuto linfatico della mucosa gastrointestinale (GALT) e nei linfonodi, con concentrazioni che superano quelle presenti nel sangue:



Ed ora, ecco la distribuzione di tenofovir nei diversi organi di un topo: la maggiore concentrazione si ha nei reni e nel fegato, la minore nel cervello, nei linfonodi mesenterici e nei testicoli.



Segue ora una diapositiva che illustra il lavoro di Paul Luciw, che ha indagato i santuari virali e la distribuzione di atripla (tenofovir, emtricitabina ed efavirenz) in uno modello di macachi rhesus: le più alte concentrazioni di DNA e RNA virali sono state rinvenute nel tessuto linfatico (milza, linfonodi e mucosa gastrointestinale).



Dallo studio dei dati presentati in queste diapositive su modelli animali, si può trarre la conclusione che esistono dei santuari non raggiunti in modo adeguato dai farmaci e che questo può avere rilevanti conseguenze in termini virologici.

La slide che segue mostra la distribuzione di diversi antiretrovirali nel tratto genitale maschile e femminile di esseri umani. Purtroppo è di bruttissima qualità, ma credo si capisca ugualmente che farmaci diversi hanno diverse capacità di penetrare negli organi genitali e stabiliscono rapporti diversi fra la loro concentrazione nel sangue e quella nello sperma e nel fluido vaginale.



Ora Fletcher entra nel vivo del lavoro suo, di Schacker e di Stevenson, perché discute i nuovi dati da loro raccolti sulla penetrazione dei diversi ARV nei linfonodi e nel tessuto linfatico del GALT e avanza la loro ipotesi, secondo cui SI VERIFICA UNA REPLICAZIONE VIRALE NASCOSTA COME CONSEGUENZA DI INSUFFICIENTI CONCENTRAZIONI DI ANTIRETROVIRALI NELLE CELLULE DEI LINFONODI E DEL TESSUTO LINFATICO PRESENTE NELLA MUCOSA GASTROINTESTINALE.



Questa è l’impostazione della sperimentazione che hanno fatto, studiando un gruppo di pazienti naive, che iniziavano la loro prima terapia con più di 250 CD4. Sono state date loro diverse combinazioni di ARV, le cui concentrazioni sono state monitorate al primo giorno, dopo 1, 3 e 6 mesi, sia nel sangue, sia nei linfonodi e nel GALT.



Ed ecco le concentrazioni rilevate nei diversi comparti in 9 diversi pazienti e, ciò che Fletcher più sottolinea, in diversi momenti. I linfonodi sono il comparto peggio raggiunto da tutti i farmaci, a differenza delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), che vengono raggiunte benissimo da tutti gli ARV presi in considerazione.



Le diverse concentrazioni raggiunte nelle PBMC, nei linfonodi e nel GALT, a sinistra dal tenofovir, a destra dall’emtricitabina.



Ed ora le diverse concentrazioni raggiunte nel plasma, nelle PBMC, nei linfonodi e nel GALT, a sinistra dall’atazanavir, a destra dall’efavirenz.



Da qui, Fletcher parte per proporre alcune osservazioni:

1. TFV-DP, FTC-TP, ATV, DRV ed EFV risultano misurabili nel plasma, nelle PBMC, nelle cellule dei linfonodi, nel tessuto dell’ileo e del retto.

2. I dati preliminari finora raccolti parlano a favore di una unica compartimentalizzazione per i farmaci analizzati (si parla dunque di specificità dei farmaci, non delle classi di farmaci) - TFV, FTC, ATV ed EFV:

• • TFV: ileo ≈ retto > PBMC > LN;
  • FCT: PBMC > LN >> ileo > retto;
  • ATV: PBMC > retto >> ileo > LN;
  • EFV: PBMC > ileo ≈ retto >> LN.

3. Questi dati preliminari forniscono una base farmacologica per ipotizzare che la replicazione nascosta dell’HIV sia una conseguenza dell’incapacità di raggiungere delle concentrazioni di antiretrovirali che sopprimano completamente la replicazione del virus nelle cellule del GALT e nei linfonodi.

Fletcher ha poi studiato le conseguenze di una concentrazione di farmaci troppo bassa, in particolare mostra la differenza fra il raltegravir assunto una sola volta al giorno e due volte al giorno, mostrando come la somministrazione unica sia peggiore della doppia.



Questi i lavori presentati al CROI che, a suo parere, sono utili per comprendere meglio la sua ricerca:



A questo punto della sua lezione, Fletcher ritorna agli aspetti di base da cui non si può prescindere se si vuole arrivare a distruggere i “santuari” e sostiene che si deve comprendere

• 1. Quali siano le barriere che si oppongono alla penetrazione e alla persistenza degli antietrovirali nei comparti che hanno rilevanza virologica. In particolare, bisogna capire:
  
  • l’espressione costitutiva degli enzimi di fosforilazione [si veda la terza slide e relativa spiegazione qui: http://hivforum.info/forum/viewtopic.php?p=8794#p8794] e lo stato di attivazione del comparto;
  • la distribuzione degli e la suscettibilità agli enzimi che metabolizzano i farmaci e dei transporters;
  • i tratti genetici dell’ospite.
  
  2. Quali concentrazioni di ARV siano associate alla massima soppressione della replicazione virale (e se queste siano le stesse che si associano alla prevenzione dell’infezione).
  
  3. Se concentrazioni insufficienti di ARV nei potenziali reservoir anatomici di replicazionedell’HIV permettano una replicazione virale persistente; e, se sì, se questo costituisca un ostacolo a una cura eradicante o funzionale dell’infezione da HIV.

Fletcher mostra il modello “classico”, che prevede che la distribuzione dei farmaci avvenga in modo uniforme in tutto il corpo e non si lascia sfuggire una battuta: “Tutti i modelli sono sbagliati. Alcuni modelli possono essere utili.”



Mostra quindi un “modello-metropolitana” dell’organismo umano, per arrivare a comprendere come i farmaci arrivino nei diversi organi.



Che cosa può consentire di distruggere i santuari descritti finora? Quella che Fletcher definisce “RISK DIRECTED THERAPY” (RDT): una terapia che riesce a minimizzare l’apporto farmacologico rispetto al rischio di replicazione virale residua.



Queste le possibili strategie:

• • una terapia che riesca a concentrarsi su obiettivi specifici;
  • dei regimi ottimizzati dal punto di vista della penetrazione nei diversi comparti anatomici;
  • dei farmaci che vadano specificamente in un determinato comparto.

Ed ecco un esempio di terapia in cui ci si concentra sull’obiettivo di controllare la concentrazione nei diversi comparti e degli effetti che questo può comportare in termini virologici:





Fletcher ripropone poi la tabella di Letendre della penetrazione e dell’efficacia dei diversi ARV nel sistema nervoso centrale:



CONCLUSIONI:

• 1. Gli antiretrovirali non si distribuiscono nel corpo in modo uniforme.
  
  2. Esistono delle relazioni fra le caratteristiche del paziente, i parametri farmacocinetici e la risposta ai farmaci.
  
  3. Una soppressione ottimale della replicazione dell’HIV, la prevenzione dell’infezione e la speranza di una cura dipendono dal fatto che si riesca a raggiungere un livello ottimale di esposizione al farmaco.

E Fletcher chiude con una citazione da un articolo di W.T Dawson uscito sugli Annals of Internal Medicine del 1940 e dedicato alle relazioni fra età, peso e dosaggio dei farmaci:

• “In breve, dopo tutta questa discussione, l’unico principio che ci rimane su come dosare un farmaco è che il dosaggio deve essere aggiustato in base al singolo paziente”.

[Leon]

Se questo Fletcher, con la sua storia della "replicazione criptica" del virus nei tessuti/organi non ben raggiunti da questo o da quell'antiretrovirale (o da tutti!!!), ha veramente ragione è un dramma, perché, in un certo senso, torniamo all'epoca pre-HAART, e per giunta con di mezzo le "caratteristiche del paziente", per cui ciascuno fa caso a sé!

Insomma, un bel disastro sia dal punto di vista pratico, sia da quello teorico e che, a ben guardare, neanche Siliciano, con i suoi studi filogenetici sulla viremia residua, che sono uno dei pilastri di tutta la teoria della "replicazione completamente soppressa dalla HAART", ha mai del tutto escluso. Uno dei suoi rovelli, infatti, è sempre stato quello della possibile "sottorappresentazione nel sangue periferico", vale a dire che il virus presente in certi distretti (cervello, in primis, ma non solo), pur replicandosi attivamente, rimanga perlopiù confinato appunto in questi distretti e perciò non si riesca a rilevare nel sangue periferico, che è quello su cui Siliciano ha sempre compiuto le indagini filogenetiche che dicevo.

...E la cosa diventa ancor più verosimile se si pensa che il sangue NON è la "casa" né dei CD4, né, tanto meno, dei macrofagi, per non parlare del fortissimo supporto che a tutto questo discorso darebbe la (parzialmente) nuova faccenda del contagio diretto da cellula a cellula, per cui il virus che si trasmette con questa modalità dal sangue non ci passa proprio!

Insomma, anche se spero più che mai di sbagliarmi, mi sembra che si stiano componendo i tasselli dell'ennesima brutta sorpresa riguardante la nostra malattia...

[Dora]

Se questo Fletcher, con la sua storia della "replicazione criptica" del virus nei tessuti/organi non ben raggiunti da questo o da quell'antiretrovirale (o da tutti!!!), ha veramente ragione è un dramma, perché, in un certo senso, torniamo all'epoca pre-HAART, e per giunta con di mezzo "le caratteristiche del paziente", per cui ciascuno fa caso a sé!

Certo, se la mettiamo giù così, sembra LA notizia ferale del CROI 2012. Però sono andata a rileggermi quel che era uscito dal seminario all’isola dei pirati e non sono sicura che le cose siano da vedersi (solo) così nere.

Anzitutto, non è che questa ricerca sia stata accettata pacificamente: Fletcher, Shacker e Stevenson sono stati duramente contestati da John Mellors, che ammetteva che possa anche verificarsi una limitata infezione de novo, ma negava che questa sia in grado di riempire i reservoir e diceva che è tutto ancora da dimostrare che si abbia replicazione e che, per far questo, si deve dimostrare che l’HIV nei tessuti cambia nel tempo, o divenendo resistente ai farmaci, o acquisendo nuove mutazioni. Questo i tre non l’hanno ancora fatto.

A questo proposito, anche la Sarah Palmer ha avuto qualcosa da dire, in quell’occasione, perché lei è andata a cercare i mutamenti del virus nei tessuti di 8 pazienti in terapia, che avevano completamente soppresso l’HIV nel sangue grazie ad antiretrovirali vari, e non ne ha proprio trovati. Ora, è vero che puoi dire che la Palmer si è messa improvvisamente ad andare per farfalle, perché non è riuscita a trovare mutazioni virali nei tessuti, né virus nelle staminali … (ehhh insomma, signora mia, la impari a fa’ el so mestee!!). (*)

Però siamo e restiamo due pesi massimi contro i tre dell’Ave Maria.

Questo, solo per provare a mettere un po’ di bianco in tutto quel nero, e senza nulla togliere al fatto che, probabilmente, hanno fatto un lavoro egregio e dal quale nessuno può prescindere.

L’ultima spruzzatina di bianco che vorrei aggiungere è che, sempre a St Martin, Fletcher & co. hanno sostenuto una cosa che non mi sembra del tutto trascurabile, perché potrebbe offrire una via d'uscita dal disastro descritto: ritengono che sia possibile arrivare ad attaccare il virus che si annida nei tessuti e che lo si possa fare precisamente trovando il mondo di bloccare quello “sgocciolio” che va a riempire il reservoir. Di qui la loro proposta di colpire/modificare i “transporter” cellulari, in modo da rendere gli ARV presenti e/o futuri capaci di raggiungere concentrazioni realmente terapeutiche anche nei tessuti, e specialmente nei linfonodi.

Un problemino che invece vedo io, legato a questa ricerca, è una questione che avevo sollevato a settembre quando uscì il lavoro di Baltimore e di nuovo a dicembre e che mi limito a riproporre, sintetizzandola, oggi - la questione di un reservoir NON latente, ma sveglissimo, che deve evidentemente essere "trattato" in modo diverso rispetto a quello latente:

(...) questo lavoro fornisce una conferma sperimentale – a mio avviso davvero importantissima – della ipotesi di Baltimore, che è stata pubblicata l’estate scorsa su Nature e di cui ho raccontato nel thread Replicazione virale durante HAART per contagio fra cellule.
Se si tiene conto che, quando fu pubblicata, la letterina di Baltimore uscì accompagnata da un editoriale di Steven Deeks in cui si auspicava che il modello matematico di contagio fra cellule in presenza di HAART soppressiva presentato ricevesse una conferma o una confutazione empirica, ma si temeva che questa si sarebbe fatta attendere a lungo, causa la difficoltà tecnica di avere accesso ai tessuti linfatici e avrebbe richiesto lo sviluppo dell'ennesimo modello animale, ritengo che l'importanza della ricerca che Shacker, Stevenson e Fletcher hanno portato a St Martin difficilmente possa essere sopravvalutata.

Detto in breve, David Baltimore ha pubblicato un modello di replicazione virale attiva durante una HAART soppressiva, che lo porta a ipotizzare che la persistenza dei reservoir, pur in presenza di una terapia che abbia successo nell’azzerare la viremia, possa essere spiegata da una infezione che si propaga da una cellula all’altra e che non è minimamente toccata dalle normali concentrazioni dei farmaci. Questo potrebbe quindi spiegare perché la HAART non riesce ad eradicare l’infezione.
Infatti, se davvero si ha replicazione virale da una cellula all’altra (e questo parrebbe proprio confermato dalla ricerca di Shacker, Stevenson e Fletcher), questa potrebbe creare un reservoir in vivo, che sarebbe diverso da un reservoir di virus latente e dovrebbe quindi essere trattato diversamente: si sostiene che il virus latente debba essere attivato e forzato ad uscire dalle cellule in cui risiedeva quiescente, per poi essere spazzato via dalla HAART. Ma questa idea non potrebbe funzionare nel caso di un virus che nelle cellule ci entra comunque, aggirando i farmaci nelle loro normali concentrazioni considerate terapeutiche e creando una fonte di replicazione intermittente, perché non entra in latenza, ma se ne resta lì ben sveglio.
Ne conseguirebbe che le strategie di eradicazione perseguite fino ad oggi siano destinate al fallimento (e direi che tutte le débâcle delle varie tecniche “micio-micio” cui abbiamo assistito in questi anni lo confermino ampiamente).
(...)
Descrivendo nei dettagli i risultati virologici nei 12 pazienti analizzati, Stevenson ha spiegato che l’analisi dei tessuti mostra una continua infezione de novo nel tessuto linfatico, nonostante la viremia nel sangue sia soppressa.
Analogamente impressionanti gli studi sull’HIV RNA presente nel tessuto linfatico: si sono rilevate particelle virali abbondanti ed estesamente distribuite in un follicolo linfatico, mentre uno adiacente appariva completamente libero dal virus.
(...)
La conclusione di Schacker, Stevenson e Fletcher è stata che l’analisi dei tessuti ha rivelato una risposta virologica agli antiretrovirali discordante fra tessuto linfatico e sangue. La continua infezione de novo può essere una conseguenza di concentrazioni subottimali dei farmaci nel tessuto linfatico e, mentre non denota una replicazione in corso, fornisce però le condizioni per riempire continuamente il reservoir.

[Dora]

(*) Dal momento che Sarah Palmer ha ribadito al CROI quanto già sostenuto a St Martin, mi pare utile riportare qui l’abstract del lavoro portato a Seattle, nella sezione di poster dedicata agli “Unconventional reservoirs” (questa volta ha diviso in due la ricerca; la parte relativa alla (fallita) caccia al virus nelle staminali è tradotta nel thread sui lavori di Kathleen Collins).
Oltre al sangue periferico, ha analizzato cellule del GALT, quindi qualcosa di utile sul virus nei tessuti linfatici dovrebbe essere in grado di dircela. Prima riporto l’abstract tradotto e poi le figure ricavate dal poster.

Paper #361 - Absence of HIV Evolution in Peripheral Blood- and GALT-derived T Cells from Patients on Long-term Suppressive Therapy

L Josefsson1,2, S Eriksson1,2, E Sinclair3, T Ho3, L Epling3, W Shao4, L Loeb3, L Poole3, F Hecht3, and Sarah Palmer*1,2
1Swedish Inst for Communicable Disease Control, Solna; 2Karolinska Inst, Solna, Sweden; 3Univ of California, San Francisco, US; and 4SAIC-Frederick, Inc, NCI-Frederick, MD, US

Background: Non si sa se l’HIV persistente sia il risultato del mantenersi di cicli di replicazione virale o del rilascio di virus da parte di cellule infette che hanno una lunga vita e, in un dato momento, vengono attivate. Per capire questo problema, abbiamo confrontato sequenze di HIV tratte dal plasma prima della terapia con sequenze di HIV intracellulare tratte dal sangue e da comparti tissutali dopo un lungo periodo di terapia.

Metodi: utilizzando tecniche di sequenziamento di un singolo genoma e di un singolo provirus, abbiamo ottenuto da 20 a 50 singoli genomi viralu da campioni di plasma prelevati prima di iniziare una terapia soppressiva da 2 gruppi di pazienti: 5 pazienti che hanno iniziato la terapia durante la fase acuta dell’infezione, quando il virus è tipicamente omogeneo; e 3 pazienti che hanno iniziato la terapia durante la fase cronica, quando il virus presenta maggiore diversità genetica. La variazione genetica e la differenza media fra pari delle sequenze pre-terapia sono state confrontate con i singoli genomi provirali dell’HIV-1 derivati da CD4 naive, memoria, memoria centrale e memoria effettrice, tratti dal sangue periferico e dal tessuto linfatico della mucosa gastrointestinale degli 8 pazienti dopo una terapia soppressiva durata dai 3 ai 12 anni.

Risultati: sia i CD4 naive, sia i memoria contenevano HIV DNA dopo un lungo periodo di terapia. Le frequenze di infezione dei CD4 memoria centrale e memoria effettrice tratti dal sangue e dal GALT erano simili in entrambi i gruppi di pazienti. In tutti gli 8 pazienti, indipendentemente dal fatto che la terapia sia stata iniziata in fase acuta o in fase cronica, le analisi filogenetiche e le misurazioni delle diversità all’interno di ciascun paziente NON HANNO RIVELATO CAMBIAMENTI NELLA DIVERSITÀ VIRALE O NELLA STRUTTURA DELLE POPOLAZIONI FRA LE SEQUENZE DI RNA RICAVATE DAL PLASMA PRIMA DELLA TERAPIA E LE SEQUENZE DI DNA TRATTE DAI LINFOCITI T LOCALIZZATI NEL SANGUE PERIFERICO E NEL GALT, NONOSTANTE PERIODI DAI 3 AI 12 ANNI DI TERAPIA SOPPRESSIVA. Numerose sequenze intracellulari di HIV identificate dopo lunghi periodi di terapia contenevano VIRUS INCAPACE DI REPLICARSI. Un paziente, che ha iniziato la terapia durante la fase cronica, presentava un clone intracellulare predominante sia nei linfociti T memoria, sia nei memoria effettrice, contenente una delezione 380pb, dopo più di 9 anni di terapia.

Conclusioni: la singolare assenza di evoluzione genetica dell’HIV nelle popolazioni virali dopo anni di terapia è un forte indicatore del fatto che nella maggior parte delle cellule tratte sia dal sangue periferico, sia dal GALT, durante una terapia soppressiva, SI HA SCARSA O NULLA REPLICAZIONE VIRALE. La scoperta di molti linfociti T contenenti identici virus incapaci di replicazione fornisce una importante dimostrazione del fatto che IL VIRUS PERSISTENTE È DOVUTO ALL’ESPANSIONE DI CELLULE CHE CONTENGONO DNA PROVIRALE INTEGRATO PIUTTOSTO CHE DI REPLICAZIONE VIRALE ATTIVA.

[Dora]

Ho trovato fra gli abstract di AIDS 2012 un lavoro misto tedesco-americano, presentato da Van Lunzen e che credo abbia una certa attinenza con la ricerca di Fletcher, Shacker e Stevenson. Tratta, infatti, della persistenza virale e dell'attivazione immunitaria nei linfonodi di persone in ART e arriva alla conclusione che sono i centri germinali dei linfonodi a costituire la maggiore fonte anatomica di replicazione e di latenza virale in persone che hanno viremia plasmatica irrilevabile grazie alla ART.


Comprehensive analysis of viral persistence and immune activation in lymph nodes of HIV-1 infected individuals during HAART

J. van Lunzen1, J. Schulze zur Wiesch1, C. Lehmann2, G. Faetkenheuer2, K. Tenner-Racz3, P. Racz3, G. Alter4, M. Altfeld4, H. Streeck4

1University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Infectious Diseases Unit, Hamburg, Germany, 2University of Cologne, Cologne, Germany, 3Institute for Tropical Medicine, Hamburg, Germany, 4Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, Boston, United States

Background: Data on HIV persistence during HAART are mainly derived from peripheral blood. We analysed our lymph node repository of about 120 lymph node (LN) samples before and during HAART to define cellular and anatomical sanctuaries of viral persistence and ongoing immune activation.

Methods: LN and corresponding PBMC samples were analysed for viral persistence by in situ hybridisation (ISH), real time PCR on proviral DNA and HIV RNA and ultrasensitive assays for plasma viral loads. Comprehensive immunological analyses were performed by flowcytomety, FACSsorting, ELISPOT, ICS, immune histochemistry and cytokine ELISAs.

Results: The main source of productive infection are CD57+ germinal center (GC) T cells which are highly activated and in cycle (Ki-67+). A minor fraction of resting T cells are perstingly infected despite HAART. Large deposits of trapped virions on FDC decline rapidly during HAART but retain abundant amounts of p24 gag epitopes on their surface which is associated with persistent immune activation and increased CD8 T cell turnover. HIV specific CTL are located primarily in LN during HAART and retained here unless HAART is interrupted. However, no new epitope specificities are generated during HAART reflected by unchanged viral load set points during STI. Follicular T helper cells in the GC`s are expanded in untreated infection and correlate well with B cell abnormalities and neutralizing antibody titers. Tregs are preferentially found in LN and overexpress functionally important immunomodulatory molecules (CD39) interfering with ATP dependent cell activation. Moreover, Il-10 induces aberrant deletion of DC by NK cells and type I interferon responses of pDC`s are skewed in LN.

Conclusions: The germinal centers of LN are the major anatomical source for productive HIV replication and latency during HAART. Major perturbations in adaptive and innate immune responses occur within LN despite successful HAART. No cure will be achieved without tackling these cellular and anatomic sanctuaries.

[Dora]

Un articolo di Angela Kashuba, Kristine Patterson e molti altri della University of North Carolina, Chapel Hill in uscita su AIDS - Differential Penetration of Raltegravir throughout Gastrointestinal Tissue: Implications for Eradication and Cure - ci riporta alla questione della diversa penetrazione degli antiretrovirali nei diversi tessuti e al problema - da risolvere assolutamente se si vuole arrivare a una cura - della scarsa penetrazione di questi farmaci nei linfonodi.

La maggior quantità di tessuto linfatico si trova nell’intestino (è il GALT – gut-associated lymphoid tissue) e contiene alte concentrazioni di CD4 attivati, facilmente infettabili, che per lo più muoiono rapidamente per gli effetti citopatici del virus o per le risposte dell’ospite, ma in parte riescono a sopravvivere e passano in uno stato di latenza dal quale, se riattivato, viene prodotto virus capace di replicarsi. Queste cellule possono non essere raggiunte dai farmaci antiretrovirali.

Si è visto che gli ARV hanno diversa capacità di penetrazione nei tessuti (per esempio Kashuba e il suo gruppo hanno studiato in passato la penetrazione nel tessuto rettale). Ma non è detto che tutte le porzioni di tessuto gastrointestinale presentino il medesimo grado di permeabilità agli ARV.

La ricerca di cui si parla in questo articolo ha dunque cercato di determinare la capacità di penetrazione di un inibitore dell’integrasi, il raltegravir, in tre segmenti del tratto gastrointestinale, fra cui il GALT, dopo una sola dose o dopo ripetuti dosaggi.

Si tratta di uno studio di farmacocinetica, in aperto, durato 7 giorni, su 15 uomini HIV negativi, sani, senza alcun tipo di problema gastrointestinale, che si sono impegnati a limitare l’assunzione di alcool e ad astenersi da farmaci, da qualsiasi attività sessuale e dall’uso di sostanze infra-rettali nelle 72 ore precedenti la somministrazione di raltegravir e per tutta la durata della sperimentazione.
I volontari hanno subito prelievi di sangue e colonscopie, durante le quali sono stati prelevati dei campioni di tessuto.

I dettagli sui parametri farmacocinetici possono essere visti nella tabella e nelle due figure sotto.
In breve, quel che si è visto è che nell’ileo terminale il raltegravir penetra rapidamente e dopo una singola dose supera di 160 volte l’esposizione plasmatica. Dopo 7 giorni di somministrazione, le concentrazioni del sangue sono raggiunte nel tessuto gastrointestinale entro 10 ore dall’assunzione della dose. Il raltegravir si accumula lungo tutto il tratto gastrointestinale con esposizioni di 150-600 volte maggiori a quelle nel sangue (dopo dosaggi ripetuti). Queste concentrazioni sono le più alte viste finora nel tessuto gastrointestinale per un antiretrovirale somministrato oralmente.

Se si vuole provare ad eradicare l’HIV distruggendo il provirus quiescente nelle cellule latentemente infette, la cinetica di decadimento virale del raltegravir suggerisce che, quando i CD4 quiescenti vengono attivati, i virioni potrebbero rapidamente essere resi non infettivi.
Kashuba e colleghi sostengono che i loro risultati dimostrano che il raltegravir raggiunge le massime concentrazioni nel GALT entro 12 ore dopo una singola dose e suggeriscono che un periodo di dosaggio più esteso non serva, se si vuole intervenire con qualche strategia che risvegli il reservoir.
Sostengono anche che, benché si possa teorizzare che le alte concentrazioni che si possono misurare un’ora dopo la somministrazione di una dose dipendono dal rapido assorbimento gastrointestinale che segue a una completa preparazione dell’intestino, le concentrazioni nel sangue suggeriscono che tale preparazione non alteri l’assorbimento del farmaco in modo significativo.
Le varie intensificazioni tentate con il raltegravir hanno dimostrato che di effetti sulla viremia residua nel plasma non se ne vedono. Questo, tuttavia, può non corrispondere a quel che accade in altre parti del corpo.
Ora, con la dimostrazione di Kashuba che il raltegravir penetra in modo rapido ed efficiente nel GALT e nel tessuto del colon-retto, sembra che ci sia un’opzione in più quando si tenta qualche strategia di risveglio del reservoir.

[Dora]

È da un anno e mezzo che sto aspettando questo articolo di Fletcher (e Schacker, e Stevenson), ma sfortuna vuole che sia stato pubblicato su Current Opinion in HIV/AIDS.
Se qualcuno ha accesso a questa rivista, può per favore scaricare e postare qui il link (che poi provvederemo a cancellare in fretta) a

• Overcoming pharmacologic sanctuaries

Grazie!

[evangelion]

c'ho provato, ma stavolta niente

[Dora]

c'ho provato, ma stavolta niente

Temo che nessuna università voglia quella rivista. E sbagliano, perché molto spesso pubblica interi numeri utilissimi. Grrrrr!
Aspetto ancora qualche giorno, ma mi sa che 'sta volta dovrò comprarmelo.
Ti ringrazio comunque per il tentativo.
A presto!

[Dora]

La traduzione della review sui santuari farmacologici e il modo per distruggerli scritta da Theodore Cory, Timothy Schacker, Mario Stevenson e Courtney Fletcher.


Overcoming pharmacologic sanctuaries

INTRODUZIONE

L’uso della ART può permettere di raggiungere livelli di HIV RNA nel plasma (viremia) che sono irrilevabili sulla base di test convenzionali nella grande maggioranza delle persone con HIV. Ciò nonostante, ci sono sempre più prove di una replicazione virale residua nei pazienti in ART soppressiva. E c’è prova di una viremia di basso livello nei pazienti con viremia soppressa dalla ART, anche se non si conosce esattamente l’origine di questa viremia di basso livello e se sia il risultato della replicazione virale residua. Grazie alla ART non sono state raggiunte né una cura sterilizzante, definita come completa eliminazione dell’HIV-1 dal corpo, né una cura funzionale, in cui non c’è replicazione virale, ma non è neppure stata eliminata ogni traccia di virus.
Se si interrompe la ART, si ha una rapida recrudescenza della viremia proveniente dai reservoir di lunga durata e questo porta a un declino dei parametri clinici e allo sviluppo di resistenze.
Possono esserci diversi ostacoli al raggiungimento di una completa distruzione dei reservoir virali, ma un’ipotesi, derivata da dati che dimostrano l’esistenza di santuari farmacologici per gli ARV negli animali, è che le concentrazioni di tutti i farmaci nei regimi di ART non siano sufficienti a sopprimere completamente la replicazione in tutti i comparti dei reservoir.
In questa review discuteremo la localizzazione e le proprietà di questi reservoir e le possibili strategie per raggiungere in quei punti concentrazioni di farmaci efficaci da un punto di vista clinico.

SANTUARI FARMACOLOGICI

In genere, i farmaci non si distribuiscono nell’intero organismo in modo uniforme. Le ragioni sono complesse e multifattoriali. L’assorbimento e la distribuzione variano in base al farmaco e alla localizzazione e dipendono dalle proprietà fisico-chimiche del farmaco, dalle dimensioni e dal tasso di infiltrazione dello specifico sito e dal modo in cui il farmaco si lega alle proteine. Fattori addizionali possono essere il fatto che un farmaco sia un substrato di trasportatori di flusso o di efflusso, gli enzimi metabolici e i polimorfismi specifici del paziente dei transporter e degli enzimi metabolici.
Questi complessi fattori possono comportare differenze significative nelle concentrazioni del farmaco in comparti diversi, così come diverse concentrazioni del farmaco in questi comparti fra un paziente e l’altro.
Mentre le misure della concentrazione del farmaco nel plasma sono facili da ottenere, le concentrazioni nei comparti ristretti e nei siti di azione di un dato farmaco sono molto più difficili da ottenere e da quantificare.
Uno studio illustrativo ha utilizzato il [18F]FPMPA, un analogo del tenofovir reso radioattivo, per determinare la distribuzione nei topi. Le concentrazioni di [18F]FPMPA nella milza e nei linfonodi mesenterici erano di 25 volte più basse rispetto alle concentrazioni nel plasma.
Le differenze nelle concentrazioni del farmaco nei comparti periferici possono limitare la capacità della ART di sopprimere completamente la replicazione dell’HIV-1.
Solas e colleghi hanno valutato le concentrazioni di indinavir, nelfinavir e lopinavir nel plasma di pazienti con HIV-1 e in diversi santuari – fra cui il fluido cerebro-spinale (CSF), il tessuto linfoide e lo sperma – e hanno trovato una variazione considerevole nelle concentrazioni del farmaco fra questi siti, e fra i diversi farmaci.

TESSUTO LINFATICO ASSOCIATO ALL’INTESTINO E AL RETTO

Il tessuto linfatico nell’intestino (GALT), così come nel retto (RALT), è il maggior sito di replicazione virale nei pazienti che non hanno soppressione virologica e può anche fungere da santuario dell’HIV-1. Anche in presenza di ART da molto tempo, ci sono conferme di HIV-1 presente in questo tessuto.
Chun ha ipotizzato che i linfociti T latentemente infetti nell’intestino comprendano anche un reservoir-chiave nei pazienti con HIV-1. Ha osservato livelli significativamente più alti di HIV-1 DNA normalizzandolo con il numero dei CD4 nel GALT rispetto ai CD4 sia quiescenti, sia attivati presenti nel sangue. E ha trovato grande somiglianza nelle sequenze fra il virus nel GALT e quello nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) – che l’ha spinto a ritenere che l’intestino costituisca un luogo di ulteriore infezione delle PBMC circolanti.
Altri hanno dimostrato una somiglianza fra le sequenze dell’HIV-1 nell’intestino e nel plasma di persone con HIV-1 – e questo fa pensare che, anche con HIV-1 RNA irrilevabile nel plasma, questi pazienti continuino ad avere una replicazione attiva nell’intestino, e che ci sia un equilibrio fra questi due comparti.
Altri studi ancora suggeriscono che le concentrazioni virali possono essere più alte lungo tutto il tratto gastro-intestinale, se confrontato con il sangue dei pazienti con HIV-1 trattati con ART. Anche i rapporti dell’unspliced RNA e del DNA erano più bassi nel colon e nel retto di questi pazienti, rispetto alle PBMC – e questo fa ipotizzare un tasso di trascrizione dell’HIV-1 più basso.
Il virus latente in questo reservoir può essere rilasciato e messo in circolo.

Probabilmente le cause di queste differenze nel carico virale sono multifattoriali. Una spiegazione farmacologica è che l’espressione degli enzimi e dei transporter che servono a metabolizzare il farmaco non sia uniforme lungo il tratto gastro-intestinale; se così fosse, ci si potrebbero attendere differenze locali nelle concentrazioni di antiretrovirali.
Per esempio, esistono fra i pazienti e anche fra le diverse sezioni dell’intestino differenze considerevoli nell’espressione di transporter quali il BCRP, la proteina multi-resistente ai farmaci (MRP)-2 e la glicoproteina P (P-gp). Piccole differenze nell’espressione di P-gp, BCRP, OCTN2 e MRP3 si rinvengono lungo tutta la lunghezza dell’intestino tenue. Studi sull’uomo hanno dimostrato notevoli variazioni negli enzimi del citocromo P450 (CYP), fra cui l’espressione del CYP3A lungo tutta la lunghezza del tratto gastro-intestinale, con la maggiore espressione del CYP che si verifica nella sezione prossimale dell’intestino.
Queste differenze possono contribuire alla presenza di siti-santuario, che garantiscono al virus un certo grado di protezione dalla soppressione da parte degli antiretrovirali.

LINFONODI

I linfonodi mesenterici sono stati identificati come un santuario. Horiike e colleghi hanno trovato un’effettiva soppressione dell’RNA virale nel plasma in macachi affetti da SIV trattati con ART. Tuttavia, quando hanno esaminato i tessuti di questi animali, hanno trovato livelli rilevabili di virus nella milza e nei linfonodi.
Livelli rilevabili di DNA e di RNA virale sono stati trovati nel tessuto linfoide di macachi aviremici trattati con ART e infetti da un SIV chimera, contenente la trascrittasi inversa dell’HIV-1. Questi animali erano stati in trattamento con efavirenz, emtricitabina e tenofovir per 26 settimane. Livelli rilevabili di virus sono stati trovati in diversi linfonodi, fra cui quelli mesenterici, assiali, inguinali, iliaci e cervicali.
Bourry e colleghi hanno osservato che in macachi infetti da SIV, trattati con zidovudina/lamivudina/indinavir (ZDV/3TC/IDV), c’erano basse concentrazioni di 3TC nel tessuto linfoide. Le concentrazioni di 3TC in questi comparti erano inversamente correlate con la persistenza del virus in questi comparti.
Solas ha riferito concentrazioni di IDV nei linfonodi circa doppie rispetto a quelle nel plasma, mentre la concentrazione del nelfinavir era in un rapporto linfonodi/plasma di 0,58, quella del lopinavir di 0,21 e quella del ritonavir di 0,64.
L’incapacità del corpo di ripulire questo comparto dal virus pur in presenza di ART sostiene l’ipotesi di una distribuzione subottimale dei farmaci ed evidenzia una sfida per il raggiungimento della completa soppressione antiretrovirale e l’eradicazione del virus.

SISTEMA NERVOSO CENTRALE E TRATTO GENITALE

Il sistema nervoso centrale (CNS) e il tratto riproduttivo, sia maschile, sia femminile, sono santuari dell’HIV-1. La distribuzione degli ARV in questi comparti è stata molto discussa e questa review non si concentra su questi siti.

MACROFAGI

I macrofagi in generale, e quelli dell’intestino in particolare, sono ritenuti un reservoir dell’HIV-1.
Zalar e colleghi hanno stabilito la presenza del virus nel tessuto duodenale. Analogamente a quanto trovato da altri, hanno scoperto del virus rilevabile nonostante la viremia plasmatica fosse irrilevabile. Mediante citometria a flusso e PCR sui macrofagi del duodeno, hanno trovato che lo 0,06% delle cellule mononucleate della lamina propria erano infette da HIV-1.
Mentre questa percentuale può sembrare bassa, a causa del grande numero di cellule presenti in questo sito, rappresenta invece un numero di cellule infette significativo. I macrofagi infetti possono fungere da “cavallo di Tròia” per la diffusione del virus attraverso il corpo, e soprattutto nel CNS.
Monociti e macrofagi esprimono transporter di efflusso, fra cui la P-gp e l’MRP, che possono comportare una diminuzione delle concentrazioni intracellulari dei farmaci antiretrovirali.
Jorajuria e colleghi hanno indagato le proprietà antiretrovirali di ZDV e IDV nei macrofagi umani derivati dai monociti. Hanno osservato una maggiore inibizione della replicazione dell’HIV-1 dalla ZDV e dall’IDV in cellule che venivano trattate anche con degli inibitori della P-gp o dell’MRP1. Questo indica che i transporter di efflusso espressi sui macrofagi mantengono in queste cellule delle concentrazioni sub-terapeutiche e spiega un possibile meccanismo mediante il quale i macrofagi possono fungere da santuario dell’HIV-1.
Da notare che nell’ambiente intra-cellulare ci sono differenze fra macrofagi e linfociti T e queste possono comportare un funzionamento di alcuni antiretrovirali in queste cellule che può essere sia più efficace, sia meno.

SCONFIGGERE I SANTUARI FARMACOLOGICI

In pazienti in ART soppressiva, la persistenza del virus in siti quali il GALT, il RALT e i linfonodi può contribuire all’attivazione immunitaria, all’incompleta ricostituzione immunitaria, a un’anomala risposta ai vaccini, a una ridotta aspettativa di vita rispetto alle persone di stessa età ma senza HIV.
Questo, unito alla prova che la ART si distribuisce peggio in questi tessuti, spiega quali sono le barriere al raggiungimento di una cura – sia funzionale, sia sterilizzante – dell’infezione da HIV-1.
Sconfiggere questi santuari farmacologici con nuovi farmaci o con nuovi modi di far arrivare i farmaci, che permettano di raggiungere concentrazioni dei farmaci nei tessuti linfoidi che sopprimano completamente la replicazione virale dovrebbe impedire il mantenimento di reservoir persistenti di virus e quindi migliorare la prospettiva di una piena ricostituzione immunitaria e di una cura funzionale o sterilizzante dell’infezione.

TERAPIA MIRATA AI COMPARTI

Mentre pochi trattamenti dell’HIV-1 hanno utilizzato la strategia di mirare specifici comparti degli ARV per eliminare il virus in questi santuari, questo approccio è usato in altre patologie e potrebbe riuscire a eliminare l’HIV-1 da santuari ristretti.
Il trattamento di persone con leucemia linfoblastica acuta infantile in genere comprende la chemioterapia intratecale, che ha minimi effetti collaterali a lungo termine.
Analogamente, pazienti con retinite da citomegalovirus sono stati trattati con ganciclovir intravitreale.
Nel trattamento dell’HIV-1, la somministrazione locale è studiata soprattutto per i microbicidi, ma può teoricamente essere utile anche per la replicazione virale residua nei santuari.
Degli studi sulla somministrazione di microbicidi nei primati, trattati sia per via vaginale, sia per via rettale, con tenofovir, hanno mostrato delle concentrazioni del farmaco rilevabili per 24 ore dopo la somministrazione. Studi simili, che utilizzavano un gel con l’1% di tenofovir somministrato alle scimmie per via vaginale, hanno trovato concentrazioni nei linfociti della vagina maggiori dell’intervallo di confidenza al 95% a 4 e 24 ore dopo la somministrazione.

BLOCCO DEI TRANSPORTER E DEL METABOLISMO

Le strategie per aumentare le concentrazioni nei santuari includono l’uso di farmaci che blocchino i transporter di flusso e di deflusso o il metabolismo degli ARV.
Il ritonavir – e ora il cobicistat – hanno dei ruoli ben noti nella farmacoterapia dell’HIV come inibitori dell’enzima CYP3A. La ricerca in vitro suggerisce che ritonavir e cobicistat migliorino anche l’assorbimento intestinale.
Degli studi con cellule monostrato Caco-2 (una linea cellulare derivata da cellule di adenocarcinoma colorettale epiteliale umano, usato comunemente negli studi di assorbimento in vitro) mostrano un aumento del trasporto degli ARV attraverso le monostrato – compresi atazanavir, darunavir e tenofovir alafenamide fumarato (GS-7340).
Questo risultato viene in parte raggiunto inibendo la P-gp e il BCRP.
Risultati simili sono stati osservati per il ritonavir.
Questa inibizione dei transporter di deflusso nell’intestino può portare ad un aumento delle concentrazioni nel plasma.
Namanja e colleghi hanno di recente segnalato che un profarmaco dell’abacavir è in grado di inibire il deflusso della P-gp. Il profarmaco è stato creato in modo da aumentare la penetrazione dell’abacavir nel sistema nervoso centrale. Sono stati utilizzati dei test in vitro, così come un modello di capillari nel cervello, e si è visto che questa molecola è capace di inibire la P-gp nel sistema di coltura cellulare e poi, quando entra nelle cellule, si converte in abacavir. È stato suggerito che questo approccio potrebbe essere utilizzato per altri antiretrovirali come mezzo per aumentare la penetrazione oltre la barriera emato-encefalica.
Le sostanze che bloccano la P-gp sono state studiate come trattamento integrativo nel cancro, ma non è stato stabilito un beneficio terapeutico.

NANOMEDICINA

Le terapie antiretrovirali in scala nano (nano ART), in genere definite come ARV formulati in particelle con una dimensione inferiore ai 100 nm, sono state proposte come approccio in grado di aumentare le concentrazioni degli ARV nei santuari.
I macrofagi derivati dai monociti negli uomini (MDM) esposti a una nanoART consistente in atazanavir, efavirenz e ritonavir, mostrano un rapido assorbimento della nanoART e un lento rilascio per un lungo periodo di tempo (15-20 giorni).
Questi prodotti di nanoART possono essere utilizzati per formare dei depositi di farmaco per una risposta prolungata, che consenta una somministrazione settimanale, o perfino meno frequente.
Concentrazioni significative di nanoART sono state rinvenute in una varietà di tessuti, fra cui fegato, milza, reni e polmoni di animali, per un certo numero di giorni dopo la somministrazione.
Dal momento che i monociti e i macrofagi circolanti si distribuiscono in tutto il corpo, compresi il cervello e il tessuto linfoide secondario, questa caratteristica è stata proposta come un mezzo per sconfiggere le barriere che impediscono l’accesso degli antiretrovirali.
Una ART in nanoformulazione inghiottita da dei fagociti mononucleati in coltura insieme a cellule dell’endotelio microvascolare del cervello umano (HBMEC) riesce effettivamente a trasferire a queste cellule la ART che è stata inghiottita.
Quando la nanoART è stata rivestita di folato, si è visto un assorbimento ancora maggiore nelle HBMEC; la nanoART ricoperta di folato è stata data a dei topi e ha raggiunto nel cervello delle concentrazioni fino a 3-, 4 volte superiori rispetto alla nanoART non ricoperta.
Kinman e colleghi hanno sviluppato una nanoparticella di IDV lipidico che ha comportato un aumento di 6 volte della concentrazione di IDV nei linfonodi di macachi trattati con le nanoparticelle, rispetto a quelli che avevano ricevuto una formulazione solubile di IDV.
Di recente, Endsley e HO hanno descritto delle nanoparticelle lipidiche di IDV ricoperte di un peptide per mirare con le nanoparticelle i CD4, e hanno osservato un aumento significativo dell’attività antivirale.
Lo sviluppo di nanoprodotti può svolgere un ruolo importante nella sconfitta delle barriere che impediscono di raggiungere una concentrazione adeguata di farmaco nei santuari. Servono dunque ulteriori studi.

MODIFICAZIONE DI FARMACI E PROFARMACI E SVILUPPO DI NUOVI FARMACI

Il processo di modificare la struttura chimica degli ARV esistenti e di svilupparne di nuovi con migliori proprietà di distribuzione del farmaco offre un altro approccio per migliorare le proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche nei santuari.
Il tenofovir alafenamide fumarato (GS-7340) è un profarmaco del tenofovir in sviluppo clinico, che ha una migliore penetrazione nel tessuto linfoide. Il farmaco presenta un assorbimento variabile: ad alti dosaggi si ha una maggiore percentuale di dose assorbita rispetto ai bassi dosaggi, ed è molto stabile nel tessuto intestinale.
Si ritiene che ciò sia dovuto alla capacità del farmaco di saturare i transporter intestinali, compresa la P-gp.
Dopo somministrazione orale, il GS-7340 raggiunge nei linfonodi delle concentrazioni di 5-15 volte più alte rispetto alla somministrazione orale del tenofovir alafenamide fumarato (TDF). Il GS-7340 produce concentrazioni intracellulari nelle PBMC circa 150 volte maggiori di quelle che raggiunge nel plasma. Questo alto grado di penetrazione intracellulare fa sì che il GS-7340 abbia un indice di selettività (una misura della concentrazione citotossica in rapporto alla concentrazione effettiva) di circa 10 volte più alto rispetto a quello del TDF.
Un altro esempio di tecnologia di formulazione di un farmaco per migliorare la penetrazione nei comparti è un complesso di zidovudina e acido ursodeossicolico. Quest’ultimo è in grado di penetrare la barriera emato-encefalica e si ritiene che questo complesso possa permettere maggiori concentrazioni nel CNS.
Studi in vitro che hanno utilizzato strati di epitelio pigmentato retinico umano hanno dimostrato una maggiore diffusione a partire dal comparto apicale a quello basolaterale delle cellule.

CONCLUSIONE

Abbiamo sempre più dati a sostegno dell’esistenza di santuari farmacologici e della possibilità che questi costituiscano un impedimento al raggiungimento di una cura funzionale o sterilizzante dell’infezione da HIV-1 con la ART oggi disponibile. In santuari come il tessuto linfoide, le concentrazioni di antiretrovirali paiono insufficienti al conseguimento della completa soppressione della replicazione virale, e questi santuari sembrano in grado di costituire un sito per lo sviluppo di resistenze.
Basandosi sul fatto che i tessuti linfoidi sono un sito primario di replicazione dell’HIV-1, la presenza di questi santuari farmacologici indica una lacuna fondamentale nella nostra comprensione delle caratteristiche farmacocinetiche e farmacodinamiche degli ARV necessarie per raggiungere la completa soppressione della replicazione dell’HIV-1 alla sua fonte.
Esistono diverse strategie per migliorare la concentrazione dei farmaci in questi santuari, sia aumentando le concentrazioni nel plasma, sia aumentando la penetrazione dei farmaci o migliorando il loro trasporto.
Passi fondamentali per arrivare a una cura dell’infezione da HIV sono altre ricerche e la traduzione degli approcci migliori in ricerche cliniche.



LETTURE CONSIGLIATE

Della bibliografia riporto solo gli articoli segnalati come di speciale o di eccezionale interesse e il commento di Fletcher e colleghi.

• Buzon MJ, Codoner FM, Frost SDW, et al. Deep molecular characterization of HIV-1 dynamics under suppressive HAART. PLoS Pathog 2011; 7: e1002314.
  The variance of HIV DNA sequences in patients was characterized, and suggests that virus reservoirs exist in these patients.
  
  Horiike M, Iwami S, Kodama M, et al. Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy. Virology 2012; 423:107–118.
  This study examined reservoirs in macaques infected with SIV. They observed considerable amounts of vRNA in the lymph nodes, less in the lungs and intestines, and lower amounts in other tissues. When the animals had ART discontinued, virus rebound occurred, suggesting that the lymph node provides a sanctuary for virus replication in the presence of ART.
  
  Clavel C, Peytavin G, Tubiana R, et al. Etravirine concentrations in the cervicovaginal compartment in HIV-1-infected women receiving etravirine-containing antiretroviral therapy: DIVA 02 study. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56:4018–4020.
  Cervicovaginal fluid from women receiving etravirine as part of their ART was assessed for drug levels and antiretroviral levels. They observed good penetration of etravirine into this compartment, as well as undetectable HIV RNA.
  
  Imamichi H, DeGray G, Dewar RL, et al. Lack of compartmentalization of HIV-1 quasispecies between the gut and peripheral blood compartments. J Infect Dis 2011; 204:309–314.
  The investigators here collected peripheral blood, as well as colon and ileum biopsy samples from patients treated with ART. They observed transcriptionally active HIV sequences in the gut of the patients, and similar transcripts in the blood of the patients.
  
  Tucker TGHA, Milne AM, Fournel-Gigleux S, et al. Absolute immunoquantification of the expression of ABC transporters P-glycoprotein, breast cancer resistance protein and multidrug resistance-associated protein 2 in human liver and duodenum. Biochem Pharmacol 2012; 83:279–285.
  The authors collected duodenal and liver samples from patients, and quantified expression of BCRP, MRP2, and P-gp. They found considerable variation between patients on expression of these transporters.
  
  Launay O, Tod M, Tscho¨pe I, et al. Residual HIV-1 RNA and HIV-1 DNA production in the genital tract reservoir of women treated with HAART: the prospective ANRS EP24 GYNODYN study. Antiviral Ther 2011; 16:843–852.
  Cervicovaginal samples from HIVþ women were assessed after the initiation of ART. Whereas many patients displayed undetectable HIV-1 RNA, many still had transient periods of viral shedding.
  
  Elion R, Cohen C, Gathe J, et al. Phase 2 study of cobicistat versus ritonavir each with once-daily atazanavir and fixed-dose emtricitabine/tenofovir df in the initial treatment of HIV infection. AIDS 2011; 25:1881–1886.
  This phase 2 trial compared cobicistat and ritonavir as pharmacoenhancers for two different antiretroviral regimens. Both regimens enhanced with either cobicistat or ritonavir displayed similar extents of virus replication inhibition. Similar findings were observed for adverse effects between cobicistat and ritonavir.
  
  Lepist EI, Phan TK, Roy A, et al. Cobicistat boosts the intestinal absorption of transport substrates, including HIV protease inhibitors and GS-7340, in vitro. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56:5409–5413.
  The authors assessed the effects of cobicistat on transporter molecules, including P-gp and BCRP. They found that in in-vitro experiments, cobicistat increased flux of a number of antiretrovirals, including atazanavir, darunavir, lopinavir, and GS-7340. This suggests that in addition to CYP3A inhibitory effects, cobicistat may also have effects on antiretroviral absorption.
  
  Holmstock N, Annaert P, Augustijns P. Boosting of HIV protease inhibitors by ritonavir in the intestine: the relative role of cytochrome P450 and P-glycoprotein inhibition based on Caco-2 monolayers versus in situ intestinal perfusion in mice. Drug Metab Dispos 2012; 40:1473–1477.
  This study examines the effect of ritonavir on P-gp function in vitro and in an in-situ intestinal perfusionmodel. They observed significant increases in saquinavir, indinavir, lopinavir, and darunavir in these models. The authors suggest that ritonavir may block P-gp function in addition to its traditionally viewed role as an inhibitor of CYP3A4.
  
  Namanja HA, Emmert D, Davis DA, et al. Toward eradicating HIV reservoirs in the brain: inhibiting P-glycoprotein at the blood-brain barrier with prodrug abacavir dimers. J Am Chem Soc 2011; 134:2976–2980.
  The authors describe an abacavir dimer that they developed as a means to inhibit P-gp function at the blood–brain barrier. They observed that these dimers are able to inhibit P-gp efflux effectively in vitro. They additionally found that within cells the dimers dissociate into monomeric forms, allowing them to function. They suggest that this approach may be of use for other antiretrovirals.
  
  Roy U, McMillan JE, Alnouti Y, et al. Pharmacodynamic and antiretroviral activities of combination nanoformulated antiretrovirals in HIV-1-infected human peripheral blood lymphocyte: reconstituted mice. J Infect Dis 2012; 206:1577–1588.
  The authors developed a nanoART system capable of a sustained response with weekly administration. When administered to mice with human peripheral blood lymphocytes, they observed that treatment decreased virus replication more potently than orally administered drugs.
  
  Kanmogne GD, Singh S, Roy U, et al. Mononuclear phagocyte intercellular crosstalk facilitates transmission of cell-targeted nanoformulated antiretroviral drugs to human brain endothelial cells. Int J Nanomed 2012; 7:2373–2388.
  The authors describe a nanoformulated ART product which can be internalized by macrophages. These macrophages can then transfer the nanoART past the blood–brain barrier. When the nanoART particles were coated with folate, they observed concentrations in the brain of mice 3–4 times higher than animals that received noncoated particles.
  
  Endsley AN, Ho RJY. Enhanced anti-HIV efficacy of Indinavir after inclusion in CD4 targeted lipid nanoparticles. J Acquir Immune Defic Syndr 2012; 61:417–424.
  The authors report on peptide coated indinavir nanoparticles targeted to the CD4 receptor of T cells. These coated nanoparticles displayed increased antiviral activities as compared to soluble drug. The nanoparticles were shown to be specific for CD4þ cells by the utilization of a CD4 blocking antibody.
  
  Babusis D, Phan TK, Lee WA, et al. Mechanism for effective lymphoid cell and tissue loading following oral administration of nucleotide prodrug GS-7340. Mol Pharm 2012; 10:459–466.
  This study describes the distribution of GS-7340 and its active metabolite in plasma and in PBMCs. They describe that GS-7340 is capable of saturating intestinal efflux transporters as part of its absorption. They further describe the stability of the drug in intestinal and hepatic tissue. They finally describe efficient loading into PBMCs, and high levels of TFV-DP in those cells.
  
  Dalpiaz A, Paganetto G, Pavan B, et al. Zidovudine and ursodeoxycholic acid conjugation: design of a new prodrug potentially able to bypass the active efflux transport systems of the central nervous system. Molec Pharmaceutic 2012; 9:957–968.
  The authors here describe a novel prodrug consisting of zidovudine and ursodeoxycholic acid as a means to increase drug penetration beyond the blood–brain barrier. They found increased permeability in in-vitro experiments, suggesting that this product can cross barriers, and can hydrolyze once it bypasses these barriers.