[STUDI]Cannon_trapianto staminali umane rese CCR5- in topi 2

[Dora]

Che cosa sta bloccando la Cannon? Anche se il suo abstract diceva ben poco, dai due report su St Martin di Margolis e di Lafeuillade si inizia a capire quali enormi problemi debba ancora affrontare prima di passare al tanto pubblicizzato trial su esseri umani.

Margolis:

Paula Cannon (USC, abstr, 44) ha raccontato del suo lavoro con i topi umanizzati e del tentativo di ottimizzare la modificazione genetica delle staminali/progenitrici ematopoietiche (HSPC) per distruggere il gene CCR5, minimizzando qualsiasi effetto avverso sulla vitalità delle cellule o sul loro potenziale ematopoietico. Le staminali autologhe vengono modificate geneticamente per diventare CCR5-negative mediante delle nucleasi. Questi enzimi sono progettati con un dominio nucleasi e con un dominio che lega il DNA, usando la ricombinazione non-omologa per riparare il danno con delle mutazioni focali che distruggono la funzione del gene-target (in questo caso il CCR5).
Due tipi di enzimi che colpiscono sia le sequenze di coppie con 3 basi, sia le sequenze di coppie con 4 basi, riescono a tagliare il 30% dei geni CCR5 nelle linee cellulari, ma solo il 4-17% nelle HSPC.
L’obiettivo è di arrivare a lavorare sulle staminali adulte su scala industriale, alterare un numero di cellule sufficienti per trapiantare un essere umano, raggiungere > 5% di distruzione del CCR5, > 80% di vitalità e di mantenimento delle proprietà delle staminali, prima di provare a trapiantarle nei pazienti.
Finalmente, i primi studi pilota saranno fatti su pazienti con linfoma HIV-correlato, presumibilmente utilizzando nucleasi trasdotte con vettori adenovirali entro linfociti T (non staminali [ma questo non cambia tutto?! che differenza ci sarebbe fra questi linfociti T modificati e quelli di June-Lalezari-Mitsuyasu?]).
Resta ancora molto lavoro da fare.


Lafeuillade:

Paula Cannon ha ricordato che gli approcci di terapia genica sono volti a creare un sistema immunitario resistente all’HIV mediante la distruzione del CCR5, al fine di sopprimere la replicazione del virus senza dover assumere antiretrovirali a vita, con i connessi problemi di costi, di accesso ai farmaci e di effetti collaterali.
Questo potrebbe funzionare:
• riducendo il serbatoio di cellule-target e dunque riducendo la replicazione dell’HIV e le sue conseguenze, quali l’infiammazione, anche nei santuari che non vengono raggiunti dai farmaci;
• ristabilendo la funzionalità del sistema immunitario, compresa la protezione di linfociti T HIV-specifici.
Inoltre, l’HIV potrebbe essere usato come agente selettivo.
In teoria, potrebbe essere necessario proteggere più dei linfociti T: anche i macrofagi, le microglia, le cellule dendritiche …
Le staminali ematopoietiche sono pertanto dei buoni obiettivi per una terapia genica anti-HIV.
Due tipi di nucleasi ingegnerizzate (le ZFN e le TALEN) consentono una distruzione permanente del CCR5. Esse funzionano sul 30% delle linee cellulari, ma solo sul 4-17% delle HSPC



Ci sono però ancora delle sfide da affrontare prima di passare alla clinica:

• • usare cellule staminali adulte tratte dal midollo osseo;
  • arrivare a produrne la dose necessaria per i pazienti;
  • raggiungere più del 5% di distruzione del CCR5 e dell’80% di vitalità delle cellule;
  • mantenere le proprietà delle staminali;
  • selezionare la prima popolazione di pazienti (pazienti con linfoma?);
  • accertare la sicurezza, compresi gli effetti off-target [tipo distruggere il CCR2], per il primo utilizzo in esseri umani delle ZFN usate su staminali ematopoietiche.

[carletto]

Che dirti Dora se riesco a capirlo anche io è un buon segno

[Dora]

Adesso, va bene tutto, va bene che questi micetti transgenici saranno utilissimi nello studio dell'FIV e dunque anche dell'HIV, e poi sono carucci così piccoli, teneri e verdolini.
Ma la notizia non è proprio una novità (ne abbiamo parlato a inizio settembre: Ottenuti i primi gatti transgenici).
La Cannon, invece di fare inutili e banali dichiarazioni sui GATTI, non farebbe meglio a dirci che cosa succede dei suoi TOPI e delle sue staminali da trapiantare su UOMINI? Poteva anche cogliere l'occasione per raccontarci che cosa sta facendo LEI con la GFP, dato che siamo fermi alle vaghissime notizie di un anno fa. E invece gioca sull'utilità dei gatti GFP-ati.

Il gattino illuminato



di Jeremy Berlin

Un gatto bioluminescente?

Non è una nuova specie, bensì il risultato di un metodo che aiuta i ricercatori a capire se è stata sviluppata resistenza alla FIV, o immunodeficienza virale felina, e che potrebbe contribuire a proteggere gli esseri umani dall’HIV/AIDS.

Come l’HIV per gli umani, la FIV provoca l’AIDS nei gatti decimando i linfociti T, che combattono le infezioni.
Lo scorso anno un’équipe condotta da Eric Poeschla della Mayo Clinic di Rochester, Minnesota, ha inserito un gene di macaco reso che produce una proteina antivirale in ovuli di felino non fertilizzati.

Per seguire, al microscopio o sotto un certo tipo di luce, il trasferimento dei geni, Poeschla ha aggiunto una proteina luminescente tratta da una medusa. Il risultato? Sono nati così gatti bioluminescenti che producono la proteina antivirale da soli. Presto si saprà se i gattini modificati sono realmente immuni alla FIV.

Paula Cannon, esperta di medicina genetica, sostiene che si tratta di un “passo fondamentale” nella ricerca genetica sull’AIDS, per la salute degli esseri umani e per quella dei gatti.


(17 febbraio 2012)

[Dora]

Una domanda per la professoressa Paula Cannon:

• Carissima Paula,
  
  ma tu ci credi veramente nelle potenzialità di pressione selettiva delle tue staminali modificate? Credi davvero che basterà “one shot” di auto-trapianto con condizionamento "all'acqua di rose" per arrivare quanto meno a una cura funzionale, se non proprio alla definitiva eradicazione?

Peccato, davvero un peccato che Cannon non fosse a Seattle e non si sia creata una discussione fra lei e Cillo-Mellors … [fra l'altro, Mellors la sua bella domandina insidiosa non ha perso l'occasione di farla a Pablo Tebas, peccato che non si sia potuto toccare il tema delle staminali: http://www.hivforum.info/forum/viewtopi ... 397#p15397.]

Ho appena ascoltato, dopo la bella lezione introduttiva di John Mellors (cfr. [CROI 2012] John Mellors – HIV reservoirs & cure research), la presentazione fra gli “oral abstracts” che Anthony Cillo ha fatto del loro comune lavoro su Plasma Viremia and Cellular HIV-1 DNA Persist Despite Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation for AIDS-related Lymphoma.

In buona parte, le informazioni su quella ricerca sono contenute nel thread dedicato alla lezione di Mellors, ma vorrei riportare qui qualcuna delle slides presentate da Cillo, perché mi pare che pongano delle serie ipoteche sulla ricerca della Cannon; ipoteche che in qualche modo rafforzano i dubbi, che abbiamo espresso più volte, riguardo all’efficacia contro l’HIV di un trapianto autologo di staminali rese CCR5-, con mini-condizionamento e privo di effetti Graft vs Host e Graft vs HIV.

Ecco le slides, che mi pare si commentino da sole:

[Dora]

In questo articolo - uscito oggi su The Sacramento Bee - si parla dei costi della ricerca, di Timothy Brown e di Sangamo.
Dal momento che, però, viene intervistata Paula Cannon, ho pensato che questo sia il thread giusto per postarlo, soprattutto perché pare che il trial clinico di Paula potrebbe essere pronto a partire nel 2014 ( ) ed è la prima volta che viene prospettata una data d'inizio.
La vedo lontana, ma almeno sembra confermare che non hanno bloccato tutto.


The Conversation: HIV cure in works, but issue is time, money

By David Lesher
Special to The Bee
Published: Sunday, Jun. 17, 2012 - 12:00 am


The first reaction when you hear Timothy Brown's story is disbelief. For such a historic figure, he is remarkably anonymous.

Brown is known to scientists as "The Berlin Patient," the only human known to have been cured of HIV/AIDS. Brown, who lives in San Francisco, carried the virus for more than 10 years until it essentially disappeared with an experimental treatment in 2007. Ever since, scientists from around the world who have tested him have yet to find any sign of HIV infection in his system.

So Brown may not be well known to the public, but "he's a rock star to scientists," said Paula Cannon, a microbiologist at USC. "We appreciate what he represents, but it's also because he was able to come out and say, 'I was that person.' "

Brown's apparent cure came from a blood transfusion involving a donor who had a rare mutation of a single gene found almost exclusively among northern Europeans. The mutated gene, believed to be traced to the Black Death, can prevent the human immunodeficiency virus, or HIV, from infecting a cell.

Today, Cannon is working with a team of scientists to duplicate the cure with funding from the $3 billion stem cell bond passed by California voters in 2004. It's going well. It has proved to be safe and to eliminate HIV in humanized mice. And in coming months, scientists hope it will receive federal approval to begin human trials.

"Basically, this will give hope to the rest of the world," Brown told me in an interview. "I believe what I went through was actually good because it's led to a lot more research. It's shown a case in point that HIV can be cured."

The possibility of curing a global pandemic like AIDS with funding from the California bond is exactly the kind of exciting potential that inspired voters to approve Proposition 71 by a wide margin. But the HIV research is also a good example of the challenge facing the state's stem cell agency as it tries to show voters that they made a good investment.

None of the research under way will reach patients until long after the 10 years of funding by the ballot measure runs out. With the HIV project, researchers hope to be in human trials by 2014, but it is likely to be at least 10 years before they can show it might work in humans. And in the case of a stem cell cure for AIDS, it would be many years after that before a treatment is widely available.

That's partly due to the caution of dealing with new and powerful techniques, and the reality that each scientific step takes time to assess. Even with rapid scientific advance, it also shows how much is still unknown.

Nobody thought stem cells might be used to cure HIV when the bond passed. Far from the embryonic stem cell treatments that inspired the ballot measure, the HIV research involves a new and growing integration of stem cell and genetic science.

Scientists have known since the early 1990s that the rare mutation of a single gene – called CCR5 – can protect against HIV infection. Brown was the test to see if it would work in somebody who did not have a natural mutation.

Brown required a blood transfusion to treat leukemia, which he developed more than 10 years after he was diagnosed with HIV. And he was fortunate to be living in Berlin at the time. His doctor, Gero Hutter, was aware of the CCR5 mutation and invited Brown to participate in an experimental transfusion aimed at both the leukemia and the HIV.

It worked. But it also took several more years for scientists to accept that Brown had actually been cured. Today, they're still working to determine whether he has a "sterile cure," where all of the virus is eliminated, or a "functional cure," where harmless traces remain.

Cannon is part of a team that is developing a genetic treatment to essentially duplicate the northern European mutation by shutting off the CCR5 gene. The treatment involves a technique developed by Sangamo BioSciences in Richmond, a collaborator with Cannon and the City of Hope in Los Angeles, beneficiaries of $14 million in state stem cell funding.

The technique, called the zinc finger nuclease, involves a molecular scissors that was discovered years ago as a defense mechanism used by some bacteria. Scientists can attach a set of biological instructions so that the scissors will enter a cell and snip the DNA precisely at the location of the CCR5 gene. When the DNA reproduces an exact copy of itself, it includes a non-functioning CCR5 gene.

Blood stem cells are then used to spread the modified DNA throughout the body. Scientists have known for decades that stem cells in the blood and skin regenerate for long periods of time so skin and blood are constantly replaced. Unlike embryonic stem cells, which can grow into any cell type, the blood and skin stem cells reproduce only themselves.

The human trials that scientists hope to begin by 2014 will be limited to lymphoma patients who also have HIV. Lymphoma patients require a blood transfusion, and scientists plan to introduce the treatment during that process.

Even if it works, the transfusion is considered too traumatic and risky to treat patients who already manage their HIV with drugs. But if it's successful, scientists hope someday to deliver the treatment in other ways, perhaps with a vaccine that would work like a virus, tracking down cells in the immune system and penetrating them with a zinc finger nuclease.

"It is something that we will be able to do," Cannon said. "I want to be able to transport this thing down to South Africa," where the vast majority of those infected with HIV are living.

Jeff Sheehy, a prominent AIDS activist and a board member at the stem cell agency, called it "the global home run. That's not in 10 years. … But this could be the beginning of something really amazing."

Cannon's confidence is not based solely on the potential HIV cure. The ability to modify genes and to deliver the treatment with a virus-like vaccine is a technique that can be used for many hereditary conditions. "This is really the holy grail of gene therapy," she said.

Several other approaches to cure HIV also are under way. And while the stem cell approach has received considerable attention among scientists and AIDS activists, it's still unclear which technique will prove most effective.

It's an exciting time for scientists who considered AIDS incurable just a couple of years ago. But for patients and the public, the excitement is tempered by the years of research ahead.

That's also a challenge for the state's stem cell agency, known as the California Institute for Regenerative Medicine. In a report adopted last month, it set ambitious goals for the five years left in its funding even as it described the lengthy time frame.

"As CIRM seeks to bring discoveries from the laboratory to new treatments … it does so with the knowledge that the cycle of discovery to translation often takes decades," the report said. "CIRM is working diligently to rapidly accelerate this process, but it is important to understand that the full fruition of CIRM's investments to date will likely take many years."

The high cost of research and the distant payoff is also a deterrent for other funding sources. So among the biggest unknowns in stem cell science, one is about how it will be sustained at a time of shrinking government budgets.

"I know what needs to be done next," Cannon said. "But it's incredibly high risk, and I think it will take a long time and quite a bit of money. But it's incredibly worth doing."

[Dora]

L'australiano Alan Trounson, fino a qualche anno fa direttore dei Monash Immunology and Stem Cell Laboratories a Melbourne, è il Presidente del CIRM (California Institute for Regenerative Medicine), l'istituto che deve finanziare il trial di Paula Cannon.
Oggi The Australian racconta di una lezione che Trounson ha tenuto alla University of New South Wales, durante la quale ha parlato del successo di Timothy Brown e della distruzione del CCR5 da CD4 e staminali via ingegneria genetica.

Quello che mi è parso rilevante del resoconto della lezione è la previsione dei tempi necessari perché si arrivi a poter trapiantare staminali modificate al di fuori dei trial clinici: 6 o 7 anni, se tutto va bene - dichiara Trounson.

[Leon]

Quello che mi è parso rilevante del resoconto della lezione è la previsione dei tempi necessari perché si arrivi a poter trapiantare staminali modificate al di fuori dei trial clinici: 6 o 7 anni, se tutto va bene

Sì, addio patria (anche considerato che i trial clinici non sono ancora cominciati e nemmeno si sa con certezza quando - e secondo me nemmeno se - cominceranno)!

[Dora]

Quello che mi è parso rilevante del resoconto della lezione è la previsione dei tempi necessari perché si arrivi a poter trapiantare staminali modificate al di fuori dei trial clinici: 6 o 7 anni, se tutto va bene

Sì, addio patria (anche considerato che i trial clinici non sono ancora cominciati e nemmeno si sa con certezza quando - e secondo me nemmeno se - cominceranno)!

Ti prego Leon, non abbattermi la Cannon! Io mi rifiuto di pensare che tutta la storia del suo trial finisca in niente. So che ogni argomentazione che potrei portare è più "di pancia" che razionale, ma voglio comunque pensare che - sia pure con una lentezza esasperante - in fase clinica ci arriverà.

***************************************

Riporto qui un post di Cesar e mio dal thread su Timothy Brown, perché - ripensando ai due lavori della Cannon presentati l'anno scorso all'incontro della ASGCT, ho avuto l'dea di andare a vedere se per caso ci fosse già stato l'incontro del 2012 e se la nostra Paula vi avesse partecipato. In effetti, sì. Al post segue l'abstract, che mostra come la tecnologia di Sangamo venga continuamente aggiustata e riaggiustata:

La Cannon dice sempre le solite cose

Ho visto tutto il video della presentazione del progetto della Cannon che avevi postato e si capisce quanto questa donna (con le palle) ami il paziente tedesco (oltre ovviamente ai suoi topi umanizzati).
Ma secondo te, la Cannon è una Ensoli versione americana, oppure sta realmente spingendo verso questo progetto?

Ahhh! Mi prendi in giro, eh?! Accostare il nome di Santa Paula a quello della Pitonessa ... che sacrilegio ...

A parte gli scherzi, Cesar, e a parte la mia viscerale passione per lei, la Cannon è una ricercatrice di grande valore. Credo stia ancora affrontando una serie di problemi tecnici e se avessi a disposizione l'archivio del forum potrei semplicemente rimandarti a qualche link. Invece, dato che di rifare tutto il lavoro fatto negli anni passati ora non ne ho proprio la forza, ti prego di accontentarti di un paio di segnalazioni "a memoria": poco più di un anno fa, qualche mese dopo i suoi "trionfi" al CROI 2011, Cannon ha partecipato a un incontro della American Society of Gene and Cell Therapy (gli abstract sono ora disponibili qui - # 99 e 314) e in quel caso si è capito bene che c'era ancora qualcosa da mettere a punto prima di passare ai trapianti su esseri umani. E infatti tutti gli ultimi interventi a congressi importanti sono stati in sostanza riproposizioni di quanto detto al CROI 2011. Purtroppo il suo nome non compare nel programma di AIDS 2012, quindi evidentemente non ha novità di rilievo da comunicare. E, come fanno gli scienziati seri, se ne sta zitta.

Comunque sia, dietro a lei c'è Sangamo, che ha un enorme bisogno di dimostrare che le sue nucleasi a dita di zinco funzionano bene; quindi penso che la previsione che Cannon ha fatto di poter partire con la fase clinica nel 2014 sia coerente con le ultime dichiarazioni del suo finanziatore principale, il presidente del CIRM Alan Trounson, che proprio l'altro giorno parlava di 6-7 anni per poter usare le staminali al di fuori delle sperimentazioni cliniche (se tutto va come deve: precisazione scontata).

A questo aggiungi che potrebbe esserci una reale novità nella modificazione delle staminali mediante distruzione del gene per il CCR5, perché è di un paio di settimane fa la notizia che una ricerca di Carlos Barbas, uno dei padri delle nucleasi a dita di zinco, potrebbe consentire di evitare l'uso di vettori per portare le ZFN a distruggere il gene (vedi da qui in poi). Se questo davvero funziona, potrebbe da un lato mettere una certa fretta a Sangamo e alla Cannon, dall'altro aprire nuove strade per trapianti autologhi meno pericolosi.

[516] Protein Kinase C Activators Enhance Zinc Finger Nuclease-Driven Genome Editing in Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Lijing Li, Ludmila Krymskaya, Jianbin Wang, Kenneth Kim, Lan-Feng Cao, Anitha Rao, Nancy Gonzalez, Cyh-anh Tran, Monica Coronado, Agnes Gardner, Amira Ahmed, Paula Cannon, Qing Liu, Philip D. Gregory, Michael C. Holmes, John Rossi, John A. Zaia, David L. DiGiusto.
Virology, City of Hope National Medical Center, Duarte, CA; Sangamo BioScience, Richmond, CA; University of Southern California, Los Angeles, CA; City of Hope National Medical Center, Duarte, CA

The HIV co-receptor CCR5 is a validated target for HIV/AIDS therapy. The apparent elimination of HIV in an AIDS patient, treated for acute myelogenous leukemia with an allogeneic transplant from a matched unrelated donor homozygous (-/-) for a naturally occurring ΔCCR5 deletion mutation supports the concept that appropriately chosen CD34+ hematopoietic stem/progenitor cell (HSPC) therapy could be used for AIDS. Since matched ΔCCR5-/- donors are exceedingly rare, we are currently developing methods to efficiently deliver zinc finger nucleases (ZFNs) transiently to HSPC and disrupt the CCR5 gene with the expectation of using these genetically modified cells in autologous HSPC transplantation.

Using an adenoviral (Ad) vector for delivery of a CCR5-specific pair of ZFNs (Ad5/F35-ZFN), we compared several classes of compounds for their ability to enhance adenoviral transduction.

Using transgene expression and ZFN-induced CCR5 gene modifying activity, results demonstrate that the protein kinase C (PKC) activators, phorbol myristate acetate (PMA) and bryostatin, enhanced both transgene expression and CCR5 modifying activity. HSPC were generated with up to 49% of CCR5 alleles disrupted under optimized conditions.

Off-target analysis revealed that CCR5 disruption was highly specific with only low level modification at the highly homologous CCR2 gene observed under these conditions.

We have established doses of PMA, bryostatin, and Ad vector that support CCR5 disruption with minimal impact on hematopoietic potential as measured in in vitro assays. Both PKC activators, PMA and bryostatin, induced the phosphorylation of extracellular signal-related kinase (ERK1/ERK2). In contrast, the PMA-induced phosphorylation of Akt and p38MAPK was not detectable in CD34+ HSPC.

Targeted disruption of the Ras/Raf/MEK signaling pathway by specific inhibitors induced significant and dose-dependent reduction in ZFN-induced CCR5 gene disruption. Thus, signaling through the Ras/Raf/MEK pathway leading to ERK phosphorylation is required for optimal CCR5 gene disruption via Ad5/F35 ZFN delivery.

Microarray analysis of CD34+ cells is being used to further understand the PKC-induced changes in the transcriptome of HSPC that lead to enhanced ZFN activity.

Date: Friday, May 18, 2012
Session Info: Poster Session: Adult Stem Cells Non-Mesenchymal (4:15 PM-6:15 PM)

[Dora]

Una delle ragioni che possono avere contribuito alla cura di Timothy Brown è l’episodio di Graft vs Host Disease di non grave entità (di grado I), che ha avuto a seguito del primo trapianto allogenico di staminali CCR5-difettive. È infatti possibile che la Graft abbia contribuito ad eliminare ogni traccia residua di virus.
L’assenza di GvHD costituisce un potenziale grave problema in un modello di trapianto autologo quale quello proposto da Paula Cannon, che non può contare su questo effetto di rigetto.

Leggendo una bella review dedicata alle terapie geniche contro l’HIV, appena pubblicata su Current Opinion in Immunology dai tre John – Burnett, Zaia e Rossi (City of Hope, il massimo per i trapianti di staminali) - ho scoperto che si sta progettando un modo per aggirare questo ostacolo: la costruzione, via ingegneria genetica, di un marcatore selezionabile nelle staminali geneticamente modificate, capace di assicurare una adeguata espansione alle cellule figlie di quelle staminali, quindi una maggiore percentuale di cellule modificate e, di conseguenza, un loro vantaggio selettivo che comporti una migliore e più duratura protezione del sistema immunitario contro l’HIV.

Un simile marcatore è stato trovato e sperimentato in due tipi di scimmie (babbuini e macachi nemestrini) da alcuni scienziati del Fred Hutchinson Cancer Center e della University of Washington di Seattle. L’articolo in cui Brian Beard, Hans-Peter Kiem e colleghi raccontano il loro lavoro è stato pubblicato sul Journal of Clinical Investigation un paio di anni fa: Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates.

L’articolo è molto complesso anche perché, nelle intenzioni degli autori, la selezione in vivo di cellule che esprimono questo marker è destinata a migliorare l’efficienza di proliferazione di cellule trapiantate per curare le malattie più svariate, da diversi tipi di cancro, a malattie ematologiche che colpiscono differenti linee cellulari (emoglobinopatie, talassemie, problemi di coagulazione …), a varie immunodeficienze, fino all’infezione da HIV.

Spero, sintetizzandolo moltissimo, di riuscire a far capire comunque qualcosa.

A detta di Beard, Kiem e colleghi, il sistema per ottenere l’attecchimento di una maggiore percentuale di cellule modificate (gene marking levels) è tramite la metil guanina metil transferasi (MGMT) mutante, che non è una robetta da usarsi con leggerezza, perché si tratta pur sempre di una azione sul DNA, ma che ha il vantaggio di non richiedere una somministrazione cronica di farmaci e può essere ottenuta con trattamenti limitati, usando l’inibitore della MGMT wild-type O6-benzilguanina (O6BG) in combinazione con N,N’-bis(2-cloroetil)-N-nitrosurea (BCNU), oppure con temozolomide (TMZ), due chemioterapici approvati per curare diversi tipi di cancro.

Gli studi condotti su topi e cani sono andati bene. L’obiettivo della ricerca di Beard, Kiem et al. era di vedere se la selezione in vivo mediata da questa MGMT mutante funziona altrettanto bene nelle scimmie e di capire anche se un trattamento citotossico quale quello con BCNU e TMZ, che sono comunque dei chemioterapici il cui meccanismo di azione consiste nel danneggiare il DNA, potrebbe essere esteso a una sperimentazione clinica su esseri umani.

Hanno dunque testato questa MGMT mutante su babbuini e macachi nemestrini che avevano ricevuto un condizionamento pre-trapianto molto leggero (a base di busulfano) e, oltre a indagare la selezione in vivo delle cellule modificate (cui era stato imposto di esprimere dei transgeni anti-HIV), hanno

• • studiato gli eventi avversi legati all’uso dei vettori retrovirali impiegati per modificare le cellule;
  • mappato i siti di integrazione dei retrovirus, per accertarsi che andassero dove dovevano e non ci fossero pericolosi off-target;
  • monitorato eventuali indizi di restrizione clonale, che potessero portare a trasformazioni leucemiche.

Tutti i risultati della ricerca sono nel full text dell’articolo linkato sopra. In sintesi, si è visto che

• • ci sono state una efficiente selezione in vivo mediata dall’MGMT e una chemioprotezione sia nei babbuini, sia nei macachi, dopo il trapianto con cellule geneticamente modificate sia mediante vettori gamma-retrovirali, sia mediante vettori lentivirali (derivati dall’HIV);
  • il ripopolamento del midollo con le cellule modificate ha mantenuto le diverse linee ematopoietiche;
  • sia prima, sia dopo la selezione in vivo mediante MGMT, il ripopolamento emopoietico è stato policlonale (dopo un trapianto – che sia standard o con staminali modificate - è preferibile avere diversi cloni che contribuiscono all’ematopoiesi, per assicurare un ripopolamento duraturo del midollo);
  • l’analisi dei siti di integrazione dopo selezione in vivo mediante MGMT suggerisce che non si sarebbero verificate mutazioni in geni proto-oncogeni;
  • la tossicità extramidollare è stata molto contenuta.

Tutto facile, allora? Non proprio: uno studio analogo a quello di Beard e Kiem (Larochelle A, et al. In vivo selection of hematopoietic progenitor cells and temozolomide dose intensification in rhesus macaques through lentiviral transduction with a drug resistance gene. J Clin Invest. 2009) ha dato dei risultati piuttosto differenti, suggerendo che le cellule modificate con MGMT mutante avrebbero avuto una selezione transitoria in un modello di macachi rhesus, con seria tossicità polmonare e gastrointestinale.
Beard e Kiem analizzano però a lungo le differenze fra le due ricerche e ritengono che, sulla base dei loro risultati, le strategie che utilizzano l’MGMT per mediare una selezione in vivo in caso di patologie genetiche o infettive che colpiscono il sistema ematopoietico, o se c'è necessità di chemioprotezione durante le terapie contro diversi tipi di cancro, sia comunque una via che merita di arrivare in fase clinica.

[Leon]

Una delle ragioni che possono avere contribuito alla cura di Timothy Brown è l’episodio di Graft vs Host Disease di non grave entità (di grado I), che ha avuto a seguito del primo trapianto allogenico di staminali CCR5-difettive.

Prima di leggere la precisazione dopo la virgola, avevo per un attimo smarrito ogni metro di misura, chiedendomi se per classificare una Graft vs Host Disease come NON "di non grave entità" fosse necessario che il paziente, come minimo, si disintegrasse.

Per quanto riguarda il resto, la mia impressione è che si pensi (o si fantastichi) di curare una malattia che non si ha idea di come curare (quella da HIV) con metodiche/strumenti che non si sanno usare (terapie geniche, e per giunta su staminali, che non sono proprio le cellulette più tranquille che esistono) e, non contenti, aggiungendo di continuo nuovi "accessori" e pasticci tutt'altro che sperimentati e dall'aria per nulla rassicurante.

In poche esplicite parole: o il metodo Cannon funziona così com'è stato "venduto" ai tempi appunto dalla Cannon, o tutt'al più con qualche piccolo ritocco MIGLIORATIVO IN TERMINI DI EFFICIENZA *E SICUREZZA* (non ritrovo più il post in cui parlavi di quel tizio che, a quanto pare, aveva trovato il modo di usare le nucleasi a dita di zinco senza bisogno di vettori), oppure può essere anche buttato via, forse per sempre e come minimo per decenni.